Клонотека генів. Основні методи скринінга

Клонотека генів (репрезентативна клонотека нуклеотидних послідовностей) – це набір різних послідовностей нуклеотидів, клонованих в складі векторних молекул, що в сумі складають весь геном досліджуваного організму чи його означену частину. Геноми ДНК гідролізують рестриктазами (наприклад MboI, сайт дії якої GATC) при певних умовах (час рестрикції, концентрація ферменту). Розміри одержаних фрагментів ДНК повинні відповідати ємності вектора. Наприклад, для клонування в космідах необхідні фрагменти ДНК довжиною 35 – 45 т.п.н., в векторах на основі фага  – 15 – 20 т.п.н., в векторах типу Charon на основі фага λ – 20 – 25 т.п.н., в плазмідних векторах – 1.5 – 3 т.п.н.

В багатьох випадках не виникає необхідності працювати з повними клонотеками генів. Крім унікальних генів в сумарній ДНК існують повтори. Для одержання експресії еукаріотних генів в клітинах прокаріотів, а також для вивчення тканиноспецифічної експресії виникає необхідність одержання кодуючих послідовностей без інтронів. Для цього створюється репрезентативна клонотека кодуючої ДНК, в якій з високою імовірністю представлені послідовності нуклеотидів мРНК, що синтезується в клітинах або тканинах.

Скринінг бібліотеки генів дослівно перекладається як “просіювання” і означає вибір необхідної нуклеотидної послідовності зі зразка ДНК. Всі методи одержання необхідних послідовностей з клонотеки генів можна поділити на прямі і непрямі. В першому випадку досліджують самі рекомбінантні молекули. До непрямих методів відносять імунологічний скринінг та скринінг за активністю білку, що кодується тим геном, який шукають. Для виявлення конкретних нуклеотидних послідовностей проводять гібридизацію досліджуваної ДНК радіоактивним зондом. Досліджувану ДНК денатурують і фіксують на твердій підложці, наприклад нітроцелюлозному або нейлоновому фільтрі. Мічений ДНК – зонд (довжиною від 100 до 1000 нуклеотидів) також денатурують і наносять на фільтр з ДНК. Для гібридизації, тобто утворення стабільного комплексу, необхідно, щоб на ділянці в 50 нуклеотидів співпадало більше 80 %. Для виділення непрореагувавших зондів фільтр промивають та візуалізують мітку, найчастіше радіоавтографією. При необхідності проаналізувати безперервну ділянку ДНК довжиною в декілька сотень тисяч пар нуклеотидів використовують метод, який отримав назву “прогулянка по хромосомі”. Цей метод базується на виділенні короткого кінцевого фрагмента вставки, що міститься в одному з рекомбінантів і використанні цього фрагмента для наступного скринінгу фагової або космідної бібліотеки з метою знаходження рекомбінанта, що містить цей фрагмент разом з сусідньою ділянкою генома. Цей другий рекомбінант використовують для ідентифікації третього і т.д., в наслідок чого утворюється набір фрагментів генома, що перекриваються. Безумовно, короткий фрагмент, який є спільним для двох клонів ДНК, повинен бути унікальним.

При наявності відповідної мРНК або ДНК в якості зонда, структуру індивідуальних генів еукаріотів можна попередньо дослідити клонуванням в бактеріях, використовуючи метод, розроблений Е.Саузерном. В рамках цього метода, що одержав назву “блотінга за Саузерном”, високомолекулярну ДНК розщеплюють рестриктазами і одержані фрагменти розділяють за розміром за допомогою електрофорезу в гелевому шарі. Після цього гель переносять на нітроцелюлозний або нейлоновий фільтр, пропускають через них буферний розчин в напрямку, перпендикулярному до напрямку дії електрофорезу. Утворюється репліка геля на фільтрі. На фільтрі дану ДНК денатурують і гібридизують з радіоактивним ДНК або мРНК зондом. Гібридизаційний сигнал реєструють радіоавтографічним методом. Дуже часто блотінг за Саузерном використовують для попереднього дослідження гена або родини генів з метою вибору оптимальної стратегії клонування.

Аналогічна методика для аналізу м-РНК одержала назву „північного блотінгу”. Сумарну або матричну РНК розділяють за допомогою електрофорезу в присутності сильного денатуруючого агенту (наприклад, формальдегіду), щоб блокувати вплив її вторинної структури на електрофоретичну рухомість. Після цього переносять її на нітроцелюлозний фільтр, де відбувається гібридизація з міченим зондом. Специфічні фрагменти РНК виявляються радіоавтографією. „Північний блотінг” допомагає порівняти розміри м-РНК та відповідної к-ДНК .

Для клонування генів, що кодують білки, які синтезуються в незначних кількостях використовуються спеціальні процедури (наприклад, збагачення м-РНК центрифугуванням в градієнті концентрації сахарози). Одним із методів є гібридизація з радіоактивним зондом молекули ДНК, що кодує цей білок. Якщо відома послідовність амінокислот такого білку можна передбачити нуклеотидні послідовності відповідних м-РНК та к-ДНК і розрахувати, які рестриктази та де саме повинні розщеплювати цю ДНК. В такому випадку скринінг клонованих к-ДНК проводиться з допомогою відповідних рестриктаз.

В якості зондів для певного гену або м-РНК, що кодують білок з визначеною послідовністю амінокислот можна використовувати набір синтетичних олігонуклеотидів. Виходячи з амінокислотної послідовності ділянки білкової молекули довжиною 5-6 амінокислотних залишків для всіх можливих послідовностей м-РНК синтезують відповідний набір комплементарних нуклеотидів, які використовують в якості зонду безпосередньо або як затравки для зворотної транскрипції та синтезу відповідної к-ДНК.

Приклади задач

1. Скільки розривів необхідно внести в молекулу ДНК довжиною 350 т.н.н. для створення репрезентативної клонотеки генів в космідах?

Розв’язання.

Космідний вектор має ємність від 35 т.п.н. до 45 т.п.н., тому для клонування в космідах необхідно утворити від 8 до 10 фрагментів і, відповідно, внести в молекулу від 7 до 9 розривів.

2. Чи доцільно створювати бібліотеку генів бактерії з довжиною хромосоми 4,5 млн п.н. клонуванням в плазмідному векторі?

Розв’язання.

Найбільша ємність плазмідного вектора 3 т.п.н. Для того щоб скласти бібліотеку генів необхідно створити:

4 500 000 : 3 000 = 1 500 клонів

Створювати таку клонотеку доцільно.

3. Скринінг скількох фагових бляшок необхідно провести, щоб перевірити геном ссавця на наявність даного гена, якщо повний гаплоїдний набір хромосом клітини містить приблизно 3 000 000 000 п.н. Зробити висновок про доцільність таких досліджень.

Розв’язання.

Ємність одного вектора на основі фага λ 15 т.п.н. Репрезентативна бібліотека генів складає:

3 000 000 000 : 15 000 = 200 000 клонів;

необхідно зробити скринінг 200 000 фагових бляшок. Клонування ДНК ссавця у фаговому векторі доцільно, але при можливості бажано було б замінити вектор на основі фагу λ замінити на вектор більшої ємності.

4. Чи можна використати в якості зонда для ДНК такого складу:

5′ AGCACTGGAATTTCCGATGGTCTTAAAGCTCCGGTTCGA 3′

олігонуклеотид такого складу:

5′ GAACCGGAGCTTTACGACCATCGGAGA 3′

Розв’язання.

Перевіримо чи є даний олігонуклеотид комплементарним ділянці ДНК:

5′ AGCACTGGAATTTCCGATGGTCTTAAAGCTCCGGTTCGA 3′

A AGGCTACCAG ATTTCGAGGCCAAG 5′

↕ ↕

G C

Олігонуклеотид є комплементарний на 100 – (2х100)/27 = 92,6%

Цей олігонуклеотид можна використовувати в якості зонда.

5. Еукаріотична ДНК довжиною 20 000 000 т.п.н. містить 80% інтронів. Скільки необхідно космідних векторів для досягнення експресії в прокаріотичних клітинах, скільки для створення повної репрезентативної бібліотеки генів?

Розв’язання.

Ємність космідного вектора ≈ 40 т.п.н. Для того, щоб створити повну репрезентативну клонотеку необхідно: 20 000 000 : 40 = 500 000 космідних векторів.

Екзони складають 100 – 80 = 20% від загальної довжини еукаріотичної ДНК, тобто 20 000 000 х 20 / 100 = 4 000 000

Для досягнення експресії в прокаріотичних клітинах необхідна інформація лише про кодуючи частину ДНК. Для цього необхідно 4 000 000 : 40 = 1 000 космідних векторів.

6. При проведенні блотінга за Саузерном під дією однієї рестриктази і гібридизації з радіоактивними зондами однієї структури утворився набір з декількох смуг. Що це може означати?

Розв’язання.

Імовірно, що ген, який визначають за допомогою цього зонда, представлений декількома копіями.

7. Фрагмент ДНК довжиною приблизно 200 000 п.н. з двох сторін обмежений генетичними маркерами, послідовність яких картовано, містить необхідний ген, розміри та місце знаходження якого невідомі. Застосовуючи метод “прогулянки по хромосомі” провели аналіз фрагменту. При ньому використовували фагову бібліотеку. Скільки приблизно необхідно для цього унікальних нуклеотидних послідовностей, чому?

Розв’язання.

Ємність фагового вектора 15 – 20 т.п.н. Таким чином, для застосування метода “прогулянка по хромосомі” необхідно, щоб приблизно на кожні 15 т.п.о. приходилась одна унікальна нуклеотидна послідовність, що дало б можливість використовувати комплементарний їй радіоактивний зонд. Відповідно на 200 000 п.н. їх буде 200 : 15 ≈ 13

8. Побудуйте схему дослідження еукаріотичної ДНК довжиною 75 т.п.н. методом “прогулянки по хромосомі”, використовуючи рекомбінантний фаг λ.

Розв’язання.

A B C D E

a b c d

Частковий гідроліз EcoRI

+кінцеві фрагменти ДНК фага λ

A a

a B b

b C c

c D d

d E

a, b, c, d – унікальні фрагменти, які використовують для скринінга кожної наступної ділянки.

9. Необхідно одержати радіоактивний зонд для проведення скринінгу бібліотеки генів печінки самця щура з метою виділення унікальної ДНК, що кодує білок α2u-глобулін. Відомо, що м-РНК , яка кодує цей білок відсутня в печінці самок. Запрпонуйте метод одержання такого зонду.

Розв’язання.

В присутності мічених нуклеотидів за допомогою зворотньої транскрипції синтезують мічену ДНК, яку гібридизують з великою кількістю м-РНК самки. Мічена ДНК звязується з м-РНК самки вся, крім ланцюга ДНК, що кодує α2u-глобулін. Його і можна використовувати в якості зонда.