Ход работы

1. Подготовка материала для анализа

1.1. Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ров­ный, волнистый, склон), степени гетерогенности почвы и ее од­нородности в ботаническом отношении. Рекомендуют с площа­ди 100 м² брать пробу из трех точек; с площади, превышающей 100 м², — из пяти по принципу конверта (четыре в точках по уг­лам и одну — ближе к центру прямоугольника); с 1 га и более — из 15 точек. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний слой толщиной 2 см.

Почвенный образец берут буром, лопатой и ножом. В поле перед взятием образца их тщательно очищают, затем обрабатывают спиртом и обжигают. Можно ограничиться очи­сткой этих предметов, если затем несколько раз воткнуть их в почву изучаемого горизонта. Укладывают образец в, заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную бан­ку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной бумагой, либо в стерильные пергаментные пакеты или пакеты из плотной бумаги. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, гори­зонта и других сведений.

Почвенные образцы анализируют в первые сутки. При необходимости допускается хранение их в холодном помеще­нии (в холодильнике) в течение двух дней. Для придания сред­нему образцу большей однородности, соблюдая все условия асептики, тщательно перемешивают почву, вынимают корни растений, различные включения.

2. Приготовление почвенной суспензии

Образцы почв отбирают с пробной площади по 3-5 образцов (рис. 1) весом по 100-200 г в стерильные пергаментные пакеты. Перед подсчетом необходимо добиться, чтобы клетки в суспензии находились в виде

Рис. I. Схема сбора образцов с опытных участков

одиночных свободноплава­ющих клеток. Для выполнения этого условия необходимо осущест­вить три процесса:

1) диспергирование почвенных агрегатов;

2) десорбцию клеток микроорганизмов с почвенных частиц;

3) разделение микроколоний на отдельные составляющие их клетки.

Эти процессы осуществляются одними и теми же приемами:

1) увлажнение почвы до состояния пасты при растирании ре­зиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке 5 мин.

2) обработка на микроизмельчителе тканей РГ-2 5 мин. при 500 об/мин (10 г почвы +90 мл воды)

3) обработка ультразвуком низкой частоты УЗДН-1 (3 мин. при силе тока 0,40 А, частота 15 кГц) (10 г почвы + 90 мл воды)

Рис. 2. Схема последовательных разведений почвы

Для учета микроорганизмов широкое распространение получили:

1) прямые микроскопические методы учета микроорганизмов;

2) учет численности микроорганизмов методом посева на твердые питате­льные среды.

Недостатком первого метода является невозможность разгра­ничить живые и мертвые клетки микроорганизмов. В силу этого данные, полученные по этому методу, превышает фактическое со­держание микроорганизмов в почве. Вторым методом же, наоборот, удается учесть только незначительную часть (0,1-1% микро - населения почвы из-за отсутствия универсальной среды, пригодной для выявления всех живых микроорганизмов почвы.

1) Прямой микроскопический метод учета микроорганизмов. Метод Виноградского в модификации Шульгиной чаще применяют в лабораторной практике. Сущность его в следую­щем. Из средней почвенной пробы берут 5 г и вно­сят в колбу Эрленмейера на 250 мл, содержащую 50 мл сте­рильной водопроводной воды. Навеску почвы предварительно растирают в стерильной агатовой или фарфоровой ступке с не­большим количеством стерильной воды. Для черноземных и темно-каштановых почв навеску растирают с 0,1%-ным рас­твором пирофосфата натрия. Затем 5 мин встряхивают и в те­чение 2—5 мин дают осесть грубым частицам.

Из полученной взвеси стерильной градуированной пи­петкой берут 0,01 мл и переносят на хорошо обезжиренное стекло. Предварительно на предметном стекле расчерчивают квадрат площадью 4 см². Нанесенную взвесь равномерно распределяют по поверхности. После того, как мазок высохнет, его заливают раствором 0,1%-ного агара (хорошо отмытый агар готовят на дистиллированной воде) и снова высушивают. Покрытый агаром препарат фиксируют 96%-ным спиртом и красят карболовым эритрозином (от 40 мин до одних суток). При ок­рашивании стекла краситель наносят на препарат предварительно покрытым фильтровальной бумагой. Остаток красителя смывают, опуская стекла в воду тыльной стороной. Затем препарат снова сушат и просматривают под микроско­пом с иммерсионной системой.

Для получения более точных результатов подсчитывают 10 полей зрения и определяют среднее число клеток в одном поле зрения. Одновременно устанавливают площадь поля зре­ния: р = r². Диаметр поля зрения измеряют при по­мощи объектного микрометра. Затем находят, сколько полей зрения (К) размещается на площади мазка (Р), равной 400 мм² по формуле:

Пример расчета: Если диаметр поля зрения равен 0,16 мм, а площадь поля зрения соответствует 0,02 мм², то

Среднее число клеток в поле зрения умножают на К и устанавливают число клеток в 0,01 мл суспензии. Для оп­ределения количества клеток в 1 мл суспензии полученное число умножают на 100, для подсчета в 1 г абсолютно сухой почвы — на степень разведения и делят на навеску абсолютно сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Использование метода прямого учета почвенных микро­организмов по Виноградскому в модификации Шульгиной по­казало, что в почве содержится в сотни и тысячи раз больше клеток микроорганизмов, чем удается учесть методом пита­тельных пластин.

2) Учет численности микроорганизмов методом посева на плотной питате­льной среде.

После предварительной подготовки почвы по схеме, указан­ной выше (рис. 2), производят посев в чашки Петри со специа­льными питательными средами. Посев производят из разведений от 1:2 до 1:10000, в зависимости от групп учитываемых микро­организмов, типа почвы, сезона, влажности и т.п. Наиболее то­чный подсчет получается, если на чашке развивается 50-200 ко­лоний бактерий и актиномицетов и 30-50 колоний грибов.

При первых анализах трудно предвидеть, сколько микроор­ганизмов содержится в почве, поэтому делают посев из двух или даже трех последовательных разведений. Для учета грибов и дрожжей берут разведения на 1-2 порядка меньше, чем для уче­та бактерий и актиномицетов.

Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Бактерий подсчитывают через 3 суток.

В чашках Петри сначала учитывают колонии в 100 полях зрения, затем определяют среднее арифметическое для одного поля зрения. Для определения числа колоний на всей чашке среднее число колоний в одном поле зрения умножают на ко­эффициент (К), который равен площади чашки Петри (Р), де­ленной на площадь поля зрения (р):

Диаметр чашки Петри измеряют линейкой, а диаметр поля зрения — под микроскопом, используя для малых увели­чений миллиметровую бумагу, а для больших (объективы 40 х и 90х) — объективный микрометр.

Подсчитав при поверхностном посеве число колоний на чашке, находят содержание клеток в 1 мл соответствующего разведения, умножая число колоний на 20, так как посеяно было 0,05 мл суспензии. Чтобы определить количество клеток в 1 г сырой почвы, их содержание в 1 мл умножают на степень разведения (10³, 10⁴, 10⁵ и т. д.).

Для учета микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы число клеток в 1 г сырой почвы делят на количество абсолют­но сухой почвы, содержащейся в 1 г сырой почвы.

Пример расчета. Установлено, что при поверхностном посеве почвенной суспензии из разведения 10^-3 число колоний на чашке равно 52; влажность почвы — 25%; при такой влажности 1 г сырой почвы содержит 0,75 г абсолютно сухой почвы. Число клеток в 1 г абсолютно сухой почвы (х) определяют следующим образом:

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1. Описать последовательность проведения работ

2. Результаты работы записать.

3. Изложить выводы по работе.