Выявление Col-плазмид

Исследование проводят методом отсроченного антагонизма по Фредерику. Испытуемые культуры (например шигеллы Зонне) засевают уколом в 1,5% мясо-пептонный агар по 4-5 штаммов на одну чашку Петри. После инкубирования в течение 24 ч при 37°С выросшие макроколонии стерилизуют парами хлороформа. С этой целью чашку размещают вверх дном и на внутреннюю поверхность крышки наносят 4-6 капель хлороформа. Через 30 мин хлороформ удаляют, выдерживая чашки с открытой крышкой 15-20 мин. Затем поверхность агара заливают слоем расплавленного и охлажденного до 48°С 0.7% мясо-пептонного агара (5 мл), предварительно смешанного 0,1 мл шестичасовой бульонной культуры индикаторного штамма (например E.coli W1655). После суточной инкубации при 37°С учитывают результат. Бактерии имеют Col-плазмиду (продуцируют колицин), если вокруг их макроколоний образовались зоны подавления роста индикаторной культуры на фоне ее роста сплошным газоном в остальных участках среды. Идентификацию вида Col-плазмид осуществляют этим же методом, используя коллекцию эталонных индикаторных культур с известной резистентностью или чувствительностью к колицинам.

Рис. 1. Выявление генетических маркеров в реакции гибридизации нуклеиновых кислот. Для простоты показаны лишь тесты с радиоактивномеченым ДНК-зондом; возможность других меток предполагается (см. текст). В фильтрационном тесте образцы ДНК денатурируют и наносят на мембрану. После инкубации с ДНК-зондом положительные образцы выявляют путем авторадиографии. При гибридизации in situ манипуляции с ДНК проводят в интактных образцах ткани, фиксируемых на предметном стекле. После инкубации с ДНК-зондом на стекло наносят фотографическую эмульсию. В зонах радиоактивной эмиссиии (т.е. там, где произошла гибридизация) на ней проявляются темные микроскопические гранулы. При гибридизации в растворе смесь ДНК-зонда и денатурированного образца инкубируют в жидкой среде. После гибридизации двухспиральные молекулы-гибриды осаждают из раствора на специальных корпускулах и отмывают от несвязанного ДНК-зонда. Присутствие в пробе ДНК-фрагмента с искомой последовательностью выявляют по радиоактивности осадка [Schaechter M., Medoff G., Eisenstein B.I. (eds.). Mechanisms of Microbial Disease. Williams &Wilkins, 1993]

С

ДНК

Термическая денатурация днк.

94С , 30-40 секунд

Отжиг праймеров.

50-60С , 20-60 секунд.

Праймер

Синтез комплементарных нитей днк.

70-72С, taq-полимераза, ДНТФ.

Дочерние днк

20-30 циклов

100 000 000 Ампликонов

Электрофорез в агарозном геле

ХЕМА ПЦР

4