Руководство по лабораторной работе

Поместите 12 пробирок для сбора фракций в штатив. Пронумеруйте свои пробирки цифрами от 1 до 10. Оставшиеся две подпишите как «Слив» и «Буфер». Или на штативе, или на пробирках, нужно написать также свои имена и класс.

С помощью пипетки отлейте 4 мл буфера для хроматографии в пробирку, подписанную «Буфер».

С нимите верхнюю крышку с колонки и отломите нижнюю пробку. Излишек буфера, в котором хранилась колонка, слейте в пробирку с надписью «Слив». БУФЕР НЕ ДОЛЖЕН СТЕЧЬ НИЖЕ ГРАНИЦЫ СОРБЕНТА. Затем закройте нижнюю часть колонки желтой крышкой.

П оместите колонку в пробирку для сбора фракций 1. Не надо стараться плотно вставить колонку в пробирку. Теперь вы готовы нанести образец (смесь белков) на колонку (или это сделает за вас учитель).

Снимите крышку, закрывающую нижнюю часть колонки. Пронаблюдайте, как выглядит верхний слой сорбента - весь буфер из колонки должен вытечь. Можно увидеть «зернистую» структуру сорбента. Осторожно нанесите одну каплю смеси белков на поверхность сорбента. Засуньте пипетку внутрь колонки и аккуратно капните, не повредив поверхность геля.

Дайте образцу время, чтобы войти в гель. Затем осторожно (по стенке) добавьте 250 мкл буфера. Вытекающая из колонки жидкость будет собираться в пробирку 1.

К огда вся жидкость из колонки вытечет, добавьте еще 250 мкл буфера. Также собирайте вытекающую жидкость в пробирку 1.

К огда вся жидкость вытечет, нанесите на колонку 3 мл буфера. Это можно сделать последовательно, нанеся три раза по 1 мл. Образец уже вошел в сорбент, так что легкое взмучивание поверхности не ухудшит разделение. Сразу после добавления 3 мл буфера перенесите колонку в пробирку номер «2» и начните считать вытекающие из колонки капли. Соберите 5 капель в пробирку 2.

8 . После того, как вы собрали 5 капель во вторую пробирку, перенесите колонку в пробирку номер «3». Перемещая колонку от пробирки к пробирке, собирайте в каждую пробирку фракции по 5 капель..

Собирайте по 5 капель в каждую следующую пробирку, пока не дойдете до 10й. В нее соберите 10 капель. После этого опять закройте колонку крышкой. Учитель скажет вам, как вы будете хранить собранные фракции и колонку.

Урок 3 – анализ результатов работы. Вопросы.

1. Почему наносимый на колонку образец имел красно-коричневый цвет?

2. Как вы думаете, почему во время нанесения образца верхняя часть колонки должна быть «сухой» (над поверхностью сорбента не должно быть буфера)?

3. Почему вам нужно было добавлять дополнительный буфер после нанесения белка? (шаги 7 и 8)

4. Посмотрите на собранные вами 10 фракций. Какие из них содержат «пики» (самые большие количества) гемоглобина и витамина В12? Фракции с самой высокой концентрацией белка или витамина окрашены наиболее интенсивно.

5. Какая из молекул, гемоглобин или витамин В12, вышла из колонки первой? Эта молекула будет самой большой или самой маленькой из двух?

Приложение А. Ответы на вопросы для учителей.

Урок 1. Вопросы по теме «Хроматография»

1а. Назовите два разных метода колоночной хроматографии

Распространенными методами хроматографии являются аффинная хроматография, ионообменная хроматография и гель-фильтрация (эксклюзионная хроматография).

1б. Приведите пример двух молекул, которые можно было бы разделить с помощью какого-либо из этих методов.

Примером разделения белков с помощью аффинной хроматографии может служить очистка антитела на сорбенте с пришитым антигеном (на уроке нужно рассказать про взаимодействие антиген-антитело). Также примером может служить очистка фермента на аффинной подложке с ковалентно присоединенным субстратом (про взаимодействие фермента и субстрата также нужно рассказать на уроке).

Примером разделения белков с помощью ионообменной хроматографии может служить разделение двух белков с очень разными изоэлектрическими точками – например, при pH 7.2 лизоцим положительно заряжен, а альбумин отрицательно (на уроке следует рассказать про изоэлектрические точки, вклад отдельных аминокислот в заряд белка, pH и.т.п.)

2а. Какой вид хроматографии используется в данной работе?

В данной работе используется эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация).

2б. Вкратце объясните, как работает применяемый в данной работе вид хроматографии.

Когда раствор, содержащий молекулы разделяемых веществ (подвижная фаза), пропускается через колонку с сорбентом (твердая фаза), состоящим из пористых гранул, мелкие молекулы фильтруются через них и выходят из колонки позже. Крупные молекулы проходят между гранулами сорбента и выходят из колонки раньше.

3. Предположим, что с помощью гель-фильтрации разделяется следующая смесь веществ: гемоглобин (65 000 Да), миоглобин (17 000 Да), миозин (180 000 Да). В каком порядке вещества будут выходить из колонки?

Первое: миозин (самый большой)

Второе: гемоглобин (средний)

Третье: миоглобин (самый маленький)

4а. Если гель-фильтрационная колонка обладает пределом проникновения в 40 000 Да, гемоглобин (65 000 Да) будет разделяться на колонке или исключаться из нее?

Гемоглобин будет исключаться из колонки. Он крупнее, чем размер пор в гранулах сорбента, и он не будет проникать в них.

4б. Витамин В12 (1 350 Да) будет разделяться или исключаться из колонки?

Молекулярный вес витамина В12 намного меньше, чем эксклюзионный предел колонки, поэтому он будет медленно фильтроваться, проходя через поры.

Урок 1. Вопросы по теме «Гемоглобин и витамин В12»

1. Что придает характерный цвет гемоглобину и миоглобину?

Связанная с белком железо-содержащая молекула, которая называется «гем». Железо обычно окрашено в рыжий или красный цвет – например, ржавый гвоздь или богатая железом почва.

2. Если спортсмен хочет повысить свою выносливость, увеличив количество кислорода, доставляемого к мышцам, как он может этого добиться?

За снабжение тканей кислородом отвечают красные кровяные клетки, содержащие гемоглобин. Увеличив количество эритроцитов в крови, можно увеличить количество гемоглобина, и как следствие, максимальное количество запасаемого кислорода. Можно добиться этого, тренируясь в горах – на высоте атмосферное давление, и, следовательно, количество кислорода в воздухе снижено, и организм реагирует на это повышенной выработкой эритроцитов. Некоторые спортсмены даже прибегают к «кровяному допингу», который представляет собой инъекции эритроцитов непосредственно в кровяное русло. Это чрезвычайно опасная процедура, потому что при чрезмерной концентрации эритроцитов кровь становится слишком густой, что может приводить к инфарктам и инсультам.

3а. Как вы думаете, в какой части тела будет больше темного мяса (богатого миоглобином) у нелетающих птиц типа страуса или индейки – в ногах или в крыльях?

Темное мясо будет больше в ногах. Активные мышцы требует хорошего снабжения кислородом и в них высоко содержание миоглобина.

3б. А у летающих птиц, например, у ястреба или утки?

В крыльях. В этом случае наиболее активные мышцы расположены именно там.

4а. Как генная терапия (когда поврежденная копия гена заменяется нормальной) может помочь больным серповидноклеточной анемией?

Генная терапия предполагает лечение больных наследственными болезнями, доставляя в их организм нормальные копии поврежденных генов. Теоретически можно вылечить больного серповидноклеточной анемией, заменив поврежденный ген гемоглобина в клетках костного мозга, производящих эритроциты, на здоровый. Нужно заметить, что, как правило, физического замещения поврежденного гена при этом не происходит. Обычно в клетку с помощью вируса просто доставляется дополнительная (нормальная) копия гена.

4б. Как генная терапия может помочь пациентам с мутацией белка-переносчика витамина В12?

Аналогично, с помощью генной терапии можно внедрить в организм людей с дефектным геном белка-переносчика нормальную копию гена.

Урок 3 – анализ результатов работы. Вопросы

1. Почему наносимый на колонку образец имел красно-коричневый цвет?

Цвет образца складывается из темно-красного цвета гемоглобина и темно-розового цвета витамина В12.

2. Как вы думаете, почему во время нанесения образца верхняя часть колонки должна быть «сухой» (над поверхностью сорбента не должно быть буфера)?

На разделение белков в процессе гель-фильтрации большое влияние оказывает диффузия. Поэтому важно наносить максимально концентрированные образцы, в маленьком объеме жидкости. Мы уменьшаем диффузию, нанося наши образцы на «сухую» поверхность сорбента, когда она не покрыта буфером.

3. Почему вам нужно было добавлять дополнительный буфер после нанесения белка? (шаги 7 и 8)

Протекание буфера через колонку необходимо для продолжения разделения, т.е. для обеспечения дальнейшего перемещения гемоглобина и витамина В12 по колонке.

4. Посмотрите на собранные вами 10 фракций. Какие из них содержат «пики» (самые большие количества) гемоглобина и витамина В12? Фракции с самой высокой концентрацией белка или витамина окрашены наиболее интенсивно.

Пиковые фракции будут немного разными у всех учеников (на процесс разделения будет влиять диффузия, нарушение поверхности сорбента во время нанесения образца, и.т.п.). В целом, пик гемоглобина должен быть во фракциях 3,4 или 5, а пик витамина В12 – во фракциях 7,8, или 9.

5. Какая из молекул, гемоглобин или витамин В12, вышла из колонки первой? Эта молекула будет самой большой или самой маленькой из двух?

Гемоглобин вышел из колонки первым. Гемоглобин гораздо больше, чем витамин В12, и ожидается, что в процессе гель-фильтрации он будет выходить раньше.

Приложение Б. Словарь терминов

Биотехнология – практическое применение знаний о живой природе, включающее в себя изменение свойств живых организмов и их использование для получения какого-либо продукта.

Буфер - жидкость, в которой растворены разделяемые молекулы во время проведения хроматографии.

Колонка - пластиковый или металлический цилиндр, плотно наполненный сорбентом.

Образец - исследуемая смесь биологически активных молекул, растворенная в буфере, которая наносится на колонку.

Сорбент - твердая фаза, на поверхности которой разделяются исследуемые молекулы в процессе хроматографии. Может состоять из маленьких (микрометрового размера) шариков из оксида кремния, покрытых активными группами (при ион-обменной хроматографии), или из сравнительно крупных гранул геля, содержащих мелкие поры (при гель-фильтрации).

Фракционирование - разделение молекул по каким-то параметрам (например, по размеру). Например, с помощью гель-фильтрационной колонки можно отделить крупные молекулы, неспособные проникать внутрь пор определенного размера, от мелких.

Фракция - собранная в отдельную пробирку часть вытекшей из колонки жидкости. Обычно во время проведения хроматографии собирают много отдельных фракций. Во время гель-фильтрации более крупные молекулы выходят в составе первых фракций, а маленькие молекулы – в более поздних фракциях.

Хроматография - процесс разделения веществ, основанный на взаимодействии двух фаз, например, жидкой фазы, в которой растворены разделяемые вещества, и твердой фазы (сорбента). Свойства твердой фазы можно подобрать так, чтобы отделять одни молекулы от других на основе определенных физико-химических параметров, таких как заряд, размер, или растворимость.

Эксклюзионный предел (предел проникновения) - верхний предел молекулярный массы для молекул, при достижении которого они уже не могут проникать внутрь пор в гранулах геля.