Экспериментальный протокол для урока 4

1. В ыньте вашу микроцентрифужную пробирку из заморозки и оттайте ее в руке. Поместите пробирку в центрифугу и осадите нерастворимый бактериальный дебрис открутив пробирку в течение 10 мин на максимальной скорости. Подпишите вашими инициалами другую микроцентрифужную пробирку.

2. Пока центрифуга крутится, подготовьте колонку для хроматографии. Хорошенько потрясите колонку, чтобы взболтать сорбент, потом резко встряхните ее одним движением, как градусник, чтобы сорбент осел. Для ускорения оседания можно также легко постучать колонкой по столу, как пачкой бумаги. Снимите верхнюю крышку с колонки и отрежьте нижнюю. Дайте всей жидкости вытечь из колонки (это займет ~3-5 минут).

3. Подготовьте колонку, нанеся на нее 2 мл буфера для уравновешивания (порциями по 1 мл хорошо промытой пипеткой). Дайте буферу стечь до отметки 1 мл над границей сорбента. Закройте колонку сверху и снизу и сохраняйте колонку при комнатной температуре до следующего занятия.

4. С разу же после окончания центрифугирования выньте пробирку из центрифуги. Осмотрите пробирку под ультрафиолетом. Бактериальный дебрис должен быть виден как осадок на дне пробирки. Надосадочная жидкость называется супернатантом. Обратите внимание на цвет осадка и супернатанта. Используя новую пипетку, перенесите 250 мкл супернатанта в чистую подписанную микроцентрифужную пробирку. Хорошо промойте пипетку.

5. Хорошо промытой пипеткой добавьте 250 мкл буфера для связывания в пробирку, содержащую супернатант. Поместите пробирку в холодильник до следующего занятия.

Вопросы к уроку 4

1. Какого цвета был осадок на этой стадии эксперимента? Какого цвета был супернатант? О чем это вам говорит?

2. Почему вы отбрасываете осадок на этой стадии?

3. Кратко опишите суть хроматографии белка и объясните ее назначение в этой работе.

Урок 5 Третья стадия очистки: хроматография белка

На этой заключительной стадии очистки вы наносите приготовленный бактериальный лизат на колонку для гидрофобной хроматографии. Помните, что GFP содержит множество гидрофобных аминокислотных остатков, которые делают его гораздо более гидрофобным чем большинство бактериальных белков. Сначала вы пропускаете супернатант, содержащий бактериальные белки и GFP в высокосолевом буфере через колонку. Соль заставляет пространственную структуру белка изменится таким образом, что гидрофобные участки оказываются на поверхности молекулы, а гидрофильные («любящие воду») оказываются внутри.

Колонка, которая стоит на вашем столе, наполнена сорбентом, состоящим из микроскопических гидрофобных шариков. Когда ваш образец в буфере с высокой концентрацией соли протекает через сорбент, гидрофобные белки прилипают к шарикам, тем сильнее, чем выше степень гидрофобности белка. (или, что тоже самое, чем более белки гидрофильные, тем меньше они связываются с сорбентом). Если понизить концентрацию соли в буфере, пространственная структура белков опять меняется так, что гидрофобные участки прячутся внутрь молекулы, а гидрофильные оказываются на поверхности. В таком состоянии белок не может связываться с колонкой и смывается с нее.

Вы будете использовать эти четыре раствора для проведения хроматографии:

Буфер для уравновешивания-буфер с высокой концентрацией соли (2 М (NH₄)₂SO₄)

Буфер для связывания-буфер с очень высокой концентрацией соли (4 М(NH₄)₂SO₄ )

Буфер для промывки-буфер со средней концентрацией соли (1.3 M (NH₄)₂SO₄

Буфер для элюции – буфер с очень низкой концентрацией соли (ТЕ, 10 mM Tris/EDTA)

Контрольный список () для ежедневной подготовки рабочих мест

Ваше рабочее место

Проверьте, что на вашем столе есть все нижеперечисленные расходные материалы и приборы перед началом работы.

Рабочее место учителя (общее)

Список расходных материалов и оборудования, которые должны лежать в общем месте, доступном всем ученикам, также приведен ниже.

Урок 5
Рабочие места учеников	Число/на пару
Пробирки для сбора фракций	3
Пипетки	1
Штатив для микроцентрифужных пробирок	1
Фломастер	1
Стакан с водой для промывания пипеток	1
Колонка для гидрофобной хроматографии	1
Крышка для колонки	1
Рабочее место учителя
Буфер ТЕ	1 бутылка
Буфер для промывки	1 бутылка
Буфер для уравновешивания	1 бутылка
УФ-лампа	1-4

Урок 5

Экспериментальный протокол

1. Возьмите три пробирки для сбора фракций и подпишите их «1», «2», «3». Поставьте пробирки в штатив. Снимите крышки с колонки и дайте буферу полностью стечь (поставьте колонку в свободную пробирку для слива). Когда верхняя граница буфера дойдет до границы сорбента, аккуратно перенесите колонку в пробирку для сбора фракций «1». Не пытайтесь засунуть колонку как можно более плотно в пробирку, в этом случае она не будет течь.

2. Предположите, что, как вы думаете, произойдет на следующих этапах и запишите ваши предположения вместе с реальными наблюдениями в таблицу на странице 45.

3. И спользуя новую пипетку, аккуратно нанесите 250 мкл супернатанта (в буфере для связывания) на колонку. Расположите носик пипетки так, чтобы жидкость медленно стекала по стенке колонки. Посмотрите на колонку под ультрафиолетом, запишите ваши наблюдения. Дайте всему объему супернатанта стечь в пробирку для сбора фракций 1.

4. Перенесите колонку в пробирку для сбора фракций #2. Промытой пипеткой так же по стенке налейте 250 мкл промывочного буфера и подождите, пока он протечет. В это время подумайте, что вы можете увидеть. Посмотрите на колонку под УФ и запишите ваши наблюдения в таблицу на стр. 45.

5. Перенесите колонку в пробирку 3. Промытой пипеткой нанесите на колонку 750 мкл ТЕ (буфера для элюции). Подождите, пока весь буфер протечет. Снова сделайте предположение о том, что вы можете наблюдать, и потом посмотрите на колонку под УФ. Запишите результат в таблицу на стр. 45.

6. Осмотрите все пробирки для сбора фракций под ультрафиолетом. Обратите внимание на разницу в цвете между фракциями. Замотайте пробирки пищевой пленкой и поставьте в холодильник до следующего занятия.