4.3 Турбидиметрический анализ
Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и рассеянием дисперсной системой светового потока. Метод аналогичен колориметрическому методу.
С точки зрения чувствительности метода, в частности при исследовании иммуноглобулинов, сравнение нефелометрии и турбидиметрии оказывается в пользу нефелометрии, т.к. этот метод более чувствителен, когда небольшое количество взвешенных частиц приводит к заметному возрастанию сигнала при незначительном фоне.
1 – источник световой энергии (лампа накаливания, импульсная лампа);
2 – полосовой фильтр;
3 – кювета с исследуемой средой;
4 – фотоприемник;
φо – интенсивность падающего потока световой энергии;
φр – интенсивность падающего потока световой энергии, рассеянного жидкой дисперсной средой;
Δλ – полоса пропускания светофильтра
Рис.4.3. Направление световых потоков при турбидиметрии
Принято считать, что если рассеяние не превышает 20% от световой энергии, поступающей в дисперсную среду, то результаты турбидиметрических измерений могут оказаться недостоверными.
Преимущество турбидиметрического анализа заключается в том, что измерения могут быть выполнены практически на любом колориметре или фотометре. Направление прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения турбидиметрических исследований показаны на рис. 4.3
Основные компоненты, которые используются при построении нефелометрических и турбидиметрических приборов, похожи и включают источник света, фильтр и фокусирующий световой поток систему линз, кювету с образцом и фотоприемник с устройствами отображения и регистрации результата.
4.4 Флуориметрический анализ
Люминесценция — это свойство вещества излучать энергию, когда равновесное состояние вещества нарушено за счет внешнего источника возбуждения.
Если возбуждение осуществляется электромагнитным излучением в видимой или ультрафиолетовой области, такой вид люминесценции принято называть фотолюминесценцией.
В свою очередь фотолюминесценция оценивается временем, в течение которого свечение падает до определенного уровня (как правило, в е раз) после прекращения возбуждения. Кратковременная фотолюминесценция называется флуоресценцией. Ее длительность определяется временем перехода молекулы из возбужденного состояния в равновесное и равна 10–8–10–9 с. Наряду с кратковременной, практически мгновенной, фотолюминесценцией существуют вещества, длительность излучения которых составляет от долей секунд до нескольких часов. Такая фотолюминесценция называется фосфоресценцией.
В медицинской лабораторной практике широко используется именно флуоресцентный анализ, который по методу применения можно разделить на две группы.
К первой относятся методы определения собственной флуоресценции исследуемого объекта, которой объект обладает, или которая появляется в результате химической реакции.
Ко второй группе относятся методы, в которых исследуемое вещество метится специальными хромофорами. Введение флуоресцентной метки в той или иной мере искажает исходные свойства объекта, но зато позволяет работать с меньшим количеством вещества.
Благодаря высокой чувствительности и избирательности флуоресцентные методы анализа по объему фотометрических исследований в медицинской лабораторной практике занимают второе место после абсорбционных методов анализа.
Направление потоков световой энергии, поясняющий принцип работы флуориметров, показан на рис. 4.4.
1 – источник световой энергии для возбуждения (газоразрядная лампа, лампа накаливания, импульсная лампа);
2 – полосовой фильтр, пропускающий поток световой энергии для возбуждения в полосе длин волн Δλ1;
3 – кювета с исследуемой средой;
4 – полосовой фильтр, пропускающий поток излученной световой энергии в полосе длин волн Δλ2;
5 – фотоприемник;
φо – интенсивность падающего потока световой энергии в полосе длин волн Δλ1 для возбуждения исследуемого раствора;
φИ – интенсивность потока световой энергии излучения, вызванного возбужденным исследуемым раствором с максимумом излучения λ2;
Δφи - интенсивность потока световой энергии излучения в полосе длин волн Δλ1.
Рис. 4.4 Направление световых потоков при флуориметрии
Источник световой энергии возбуждения (1) совместно с полосовым фильтром (2) формирует световой поток, как правило, в ультрафиолетовой области в полосе длин волн 1. Поток возбуждения с максимумом 1 пронизывает кювету (3), в которой находится исследуемое вещество, способное люминесцировать и тем самым стать другим источником излучения, имеющим максимум 2. Пройдя полосовой фильтр (4), световая энергия возбужденного источника в полосе длин волн 2 попадает на фотоприемник (5).
Подробно теоретические основы метода флуоресцентного анализа и его техническая реализация будут рассмотрены ниже.