Лабораторно - практическое занятие № 11.

Тема: Выделение чистых культур микроорганизмов.

Цель работы: Ознакомить студентов с методами выделения чистых культур.

При изучении физиолого-биохимических особенностей и цикла развития бактерий, а также для установления их видовой принадлежности необходимо работать с чистой культурой мик­роорганизмов. Чистой называют такую культуру, которая по­лучена из одной клетки и содержит микроорганизмы одного вида.

Выделение чистой культуры включает три этапа: получение накопительной культуры, выделение чистой культуры, оп­ределение ее чистоты.

Для получения накопительной культуры определенного вида бактерий сначала подбирают элективные (избирательные) условия среды, обеспечивающие преимущественное развитие данных бактерий. Затем из мест обитания, в которых преобла­дают представители данной группы, делают посев на соответ­ствующую элективную (селективную) среду.

Чистую культуру получают из одной клетки или отдель­ной колонии накопительной культуры. Во втором случае из накопительной культуры после ее разведения делают высев на плотную среду по методу Коха. Каждую образовавшуюся колонию считают развившейся из одной клетки.

Для выделения из накопительной культуры чистых куль­тур аэробных бактерий делают высев на чашки Петри: капли соответствующего разведения осторожно размазывают стерильным стеклянным шпателем по поверхности плотной cpеды, после чего этим же шпателем протирают поверхность последующих 3—4 чашек. Чашки выдерживают в термостате от 2 до 7 сут, так как скорость роста различных микроорганизмов неодинакова. Выросшие на некотором отдалении от других колонии отсевают петлей в пробирки на поверхность скошенной плотной среды или в жидкую среду.

Высев из накопительной культуры микроорганизмов, относящихся к факультативным аэробам или факультативным анаэробом, для получения изолированных колоний делают ме­тодом глубинного посева в пробирки со столбиком стерильно­го агара. Для этого стерильной иглой берут чистую культуру из колоний, одновременно вынимают пробку, обжигают кран пробирки, держа ее вверх дном, и над горелкой делают иглой прокол до дна.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий по методу Коха возможно только при ограничении доступа кислоро­да, в частности при инкубации в анаэростате.

Чистоту культуры определяют микроскопированием препарата.

Контрольные вопросы:

1. Что такое чистая культура?

2. Таза культураны бөліп алу қалай жүзеге асырылады?

3. Что называют накопительной культурой?

4. Техника получения чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий.

Лабораторно - практическое занятие № 12

Тема: Молочнокислое брожение

Цель работы: Ознакомить студентов с микробиологией молочных продуктов.

Микроскопирование молочнокислых бактерий.

Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения овощей, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр; кислый вкус черного хлеба определяется молочной кислотой. Данные процессы вызыва­ют молочнокислые бактерии, которые разнообразны и широ­ко распространены в природе. Молочнокислые бактерии обитают на поверхности рас­тений, в молоке, на пищевых продуктах, в кишечнике человека и животных. Они имеют много общих признаков, важнейшими из которых являются:

- способность к синтезу молочной кислоты;

- грамположительность;

- отсутствие спор;

- неподвижность;

- форма (кокки или палочки);

- требовательность к источникам азота (многие из них не развиваются на простых синтетических средах);

- отсутствие фермента каталазы;

- способность к расщеплению перекиси водорода до воды и кислорода.

Последнее свойство выявляется, если на колонию молочнокислых бактерий нанести каплю 3%-ного раствора перекиси водорода: выделение кислорода при этом не происходит. Колонии бактерий, синтезирующих каталазу, в таких условиях покрываются пузырьками кислорода.

Молочнокислые бактерии можно разделить на две группы:

- гомоферментативные, образующие из сахара в основном одну молочную кислоту

С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СНОНСООН

Глюкоза Молочная кислота

- гетероферментативные, образующие наряду с молочной кислотой значительные количества побочных продуктов

С₆Н₁₂О_{6 =}СН₃СНОНСООН + СН₃СООН + СН₃СН₃ОН + СО₂

Глюкоза Молочная Этиловый Уксусная Диоксид

кислота спирт кислота углерода

2С₆Н₁₂О₆ = 2СН₃СНОНСООН + ЗСН₃СООН (бифидоброжение)

Молочнокислые бактерии сбраживают моно- и дисахариды. Чаще бактерии, обитающие в молоке, сбраживают лак­тозу, но никак не воздействуют или слабо воздействуют на са­харозу. Обычно лактоза подвергается гидролизу с образовани­ем глюкозы и галактозы, а затем уже происходит брожение.

При изучении молочнокислого брожения лучшая пита­тельная среда — молоко. В нем есть все необходимые для раз­вития молочнокислых бактерий элементы. В такой среде могут развиваться и другие бактерии (гнилостные, маслянокислые), но молочная кислота быстро подавляет их рост.

Критические значения реакции среды (рН) для развития не­которых групп бактерий:

- молочнокислые.......4,0—3,5;

- маслянокислые........5,0—4,7;

- гнилостные..............5,5—5,0.

Микроскопирование молочнокислых бактерий. Если простоквашу хранить при комнатной температуре, то на ее поверхности появляется белая или кремовая бархатистая мор­щинистая пленка. Такая же пленка обычно бывает на поверх­ности рассола при квашении огурцов, капусты и других ово­щей. Это молочная плесень — Geotrichum candidum (Oidium lactis), которая всегда сопутствует молочнокислому брожению, являясь его нежелательным спутником. Она окисляет молоч­ную кислоту, образуемую молочнокислыми бактериями, до СО₂ и Н₂О, снижая кислотность среды. В результате кисло­молочные и квашеные продукты начинают портиться, так как в среде происходит развитие гнилостных бактерий.

Молочная плесень — аэробная форма, поэтому разви­вается только на поверхности. Имеет многоклеточный мицелий, который распадается на отдельные клетки, так называе­мые оидии, по форме напоминающие дрожжи и служащие для размножения.

Для микроскопических наблюдений за молочнокислыми бактериями готовят препарат из прокисшего молока. Бактериологическую петлю вводят в сгусток и, повернув вокруг оси, извлекают, прикасаясь ею к пленке, которую образует масляная плесень. Сгусток размазывают по предметному стеклу очень тонким слоем без воды. Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с эфиром (приблизительно 1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая ее. При такой фиксации не только погибают и прикрепляются к стеклу бактерии, но и с помощью эфира извлекается и удаляется жир, капли которого на препарате мешают окраске и микроскопированию.

Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим 2—3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Метиленовый синий — лучший краситель для молочнокислых бактерий молока, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо — клетки микроорганизмов. На препарате преобладают мелкие округлые клетки Lactococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Эта бактерия — возбу­дитель естественного скисания молока в средних широтах. Оптимальная температура для ее развития — 30 °С. Она способствует накоплению в молоке до 1% молочной кислоты.

Нередко на препарате видны разных размеров тонкие па­лочки обычно правильной формы рода Laciobcillus, иногда со­держащие зерна волютина. Чаще встречается Lactobacillus bulgaricus

Рис. 5. Lactobacillus bulgaricus Рис. 6. Молочная плесень

Geotrichum candidum

(рис. 5) — возбудитель естественного скисания молока в южных широтах. Оптимальная температура ее развития — 40 °С, она кислотоустойчива, накапливает до 3,5% молочной кислоты. На плотных средах эта бактерия образует мелкие характерные колонии в виде комочков ваты, как правило, выпуклые, непрозрачные, непигментированные.

Если на поверхности прокисшего молока появилась пленка, то в мазке обнаруживается также и молочная плесень (рис. 6). Прямоугольные или овальные клетки ее отличаются от молочнокислых бактерий большими размерами.

Можно приготовить также фиксированные препараты из кисломолочных продуктов (йогурта, кефира, ацидофилина, ряженки, бифидока и др.) и зарисовать доминирующие формы.

Препараты из силоса или квашеной капусты готовят следующим образом: сначала втирают в предметное стекло кусочки силосуемой массы (или капусты), подсушивают и фиксируют над пламенем горелки. Остывший препарат окрашивают эритрозином (он в отличие от фуксина не окрашивает растительные элементы). И в силосе, и в квашеной капусте преобладают тонкие, хорошо прокрашивающиеся палочки L. plantarum.

Контрольные вопросы:

1. Что такое брожение?

2. В чем заключаются отличия брожения от дыхания?

3. Перечислите признаки, общие для всех молочнокислых бактерий.

4. На какие виды делится молочнокислое брожение?

5. Перечислите конечные продукты гомоферментативного молочнокислого брожения.

6. Перечислите конечные продукты гетероферментативного молочнокислого брожения.

7. В каких отраслях производства используются микроорганизмы, осуществляющие молочнокислое брожение?

8. Техника микроскопирования молочнокислых бактерий.