4.3.3 Основные правила работы с микроскопом

Место для микроскопа выбирается подальше от прямого солнечного света. Работа на столе с темной поверхностью способствует меньшему утомлению глаз.

Рекомендуется смотреть в окуляр левым глазом, не закрывая правого. В случае работы с бинокулярной насадкой сначала регулируется расстояние между окулярами в соответствии с расстоянием между глазами наблюдателя так, чтобы поля зрения обоих окуляров слились в одно.

Переносить микроскоп необходимо двумя руками: одной держать штатив, другой – основание микроскопа. Следует предохранять микроскоп от толчков, соприкосновения с сильнодействующими веществами типа кислот и щелочей. Не рекомендуется вынимать окуляр из трубы, чтобы не загрязнять пылью трубу и объективы. Во время работы желательно защищать микроскоп от дыхания, так как конденсация паров ведет к его порче.

При микроскопии препаратов с сухим объективом следует придерживаться определенного порядка в работе:

а) ставят объектив с малым увеличением (8) и при этом увеличении устанавливают наилучшее освещение; наилучшее освещение достигается при регулировке положения зеркала, конденсора и диафрагмы; при просмотре неокрашенных препаратов применяют суженную диафрагму и опущенный конденсор, при наблюдении окрашенных препаратов – открытую диафрагму и поднятый конденсор;

б) помещают препарат на предметный столик микроскопа, под объектив, и укрепляют зажимами;

в) опускают объектив (8) при помощи макрометрического винта почти до соприкосновения с предметным стеклом, на расстояние около 0,5 см от предметного столика;

г) медленно вращают макровинт против часовой стрелки до появления четкого изображения препарата, после чего наводят резкость микрометрическим винтом, который вращают в пределах одного оборота мактовинта;

д) повернув револьвер, устанавливают объектив со средним увеличением (20; 40; 60);

е) после окончания работы, следует снять препарат с предметного столика, опустить конденсор, поставить под тубус объектив 8, мягкой тканью протереть микроскоп и убрать его в футляр.

При работе с иммерсионным объективом необходимо соблюдать следующие правила и порядок работы:

а) на приготовленный и окрашенный мазок нанести небольшую каплю иммерсионного масла (не размазывая по стеклу) и поместить препарат на предметный столик;

б) установить зеркало плоской стороной и поднять конденсор;

в) повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива 90;

г) осторожно опустить тубус микроскопа до погружения объектива в каплю масла, при этом наблюдая сбоку;

д) установить ориентировочный фокус при помощи макрометрического винта;

е) провести окончательную фокусировку препарата микромет-рическим винтом, вращая его в пределах только одного оборота;

ж) по окончании работы микроскопа необходимо специальной салфеткой тщательно вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый сухой объектив 8.

4.3.4 Различные методы микроскопии

Кроме светооптической микроскопии к методам микроскопии относят: темнопольную, фазово-контрастную, люминесцентную и электронную микроскопии.

4.3.4.1 Темнопольная микроскопия

Метод наблюдения в темном поле, разработанный австрийским ученым Зигмонди, дает возможность повысить разрешающую способность микроскопа в 10 раз. В основе метода лежит явление Тиндаля – освещение объекта косыми лучами света. Эти лучи, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит темным. В то же время оптически неоднородные клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой степени, что лучи попадают в объектив. Тогда наблюдатель видит в темном поле интенсивно светящиеся объекты, поскольку лучи света идут именно от них.

Темное поле зрения можно создать в светооптическом микроскопе, заменив обычный конденсор темнопольным и применив для освещения источник сильного света. Однако эффект темного поля может быть достигнут только в том случае, если апертура конденсора превышает на 0,2…0,4 единицы апертуру объектива. Для исследования в темном поле рекомендуется конденсор с апертурой около 1,2 и объективы с апертурой от 0,65 до 0,85.

Метод используется с целью исследования живых клеток микроорганизмов. Особенно он ценен для функционально-морфологического изучения крупных объектов типа дрожжей. Цитоплазма дрожжевых организмов (при условии яркого источника света и хорошего апохроматического иммерсионного объектива) слабо и равномерно опалесцирует. На ее фоне четко различаются черные оптически пустые вакуоли. Капли жира выделяются как сильно блестящие гранулы. Протопласт погибающих клеток опалесцирует молочно-белым цветом.

4.3.4.2 Фазово-контрастная микроскопия

Человеческий глаз выявляет только различия в длине (цвете) и амплитуде (интенсивности, контрастности) световой волны, но не улавливает различий в фазе.

Почти все живые клетки прозрачны, так как световые лучи, проходя через живую клетку, не меняют своей амплитуды, хотя и изменяются по фазе.

Превратить фазовый (неконтрастный) препарат в «амплитудный» (контрастный) можно, либо окрашивая объект (для живых клеток этот прием малопригоден), либо снижая апертуру конденсора путем прикрывания диафрагмы (прием также нежелателен, так как снижается разрешающая способность микроскопа).

Метод фазово-контрастной микроскопии, предложенный голландским физиком Цернике для наблюдения за прозрачными объектами, основан на преобразовании фазовых изменений, претерпеваемых световой волной при прохождении через объект, в видимые амплитудные с помощью специального оптического устройства. Если в объектив обычного микроскопа вмонтировать специальный диск – фазовую пластинку с кольцом, а в конденсор – кольцевую диафрагму (непроницаемую для лучей света пластинку, в которой имеется прозрачная щель в виде кольца), так чтобы через конденсор и объектив проходило лишь кольцо света, которое затем совмещается с кольцом фазовой пластинки объектива, то фазы проходящего светового луча сдвигаются и можно наблюдать эффект фазового контраста.

Для проведения исследований необходимо в дополнение к световому микроскопу иметь фазово-контрастное устройство (в настоящее время наиболее широко применяются модели КФ-1 или КФ-4), которое состоит из фазовых объективов, конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста).

Метод применяют для исследования живых клеток микроорганизмов, контрастность которых достигается оптическим путем без вмешательства в физиологические процессы изучаемых объектов.

4.3.4.3 Люминесцентная микроскопия

Основана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция (от lumen – свет) – свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: света, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция – люминесценция объекта под влиянием света. Некоторые биологические объекты способны при освещении коротковолновыми лучами (сине-фиолетовыми, ультрафиолетовыми) поглощать их и испускать лучи с более длинной волной (светиться желто-зеленым или оранжевым светом). Это так называемая собственная (первичная) люминесценция, которая наблюдается без предварительного окрашивания объекта. Вторичная (наведенная) люминесценция возникает после окраски препаратов специальными люминесцирующими красителями – флюорохромами (акридином желтым, акридином оранжевым, аурамином, примулином, конго красным, тетрациклином, хинином). Препараты, окрашенные флюорохромами, изучают в средах, не люминесцирующих под действием коротковолновых лучей,  в воде, глицерине, вазелиновом масле или физиологическом растворе.

Преимущества люминесцентной микроскопии по сравнению с обычными методами заключаются:

 в сочетании цветного изображения и контрастности объектов;

 возможности изучения морфологии живых и убитых клеток микроорганизмов в питательных средах и тканях животных и растений;

 исследовании клеточных микроструктур, избирательно поглощающих различные флюорохромы, которые являются при этом как бы специфическими цитохимическими индикаторами;

 изучении функционально-морфологических изменений клеток;

 использовании флюорохромов при иммунологических реакциях и подсчете бактерий в образцах с невысоким их содержанием.

Для люминесцентной микроскопии готовят на предметных стеклах препараты-мазки или нативные препараты, которые окрашивают специальными флюоресцентными красителями. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.

4.3.4.4 Электронная микроскопия

Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа, практически составляющая от 0,1 до 0,2 нм, позволяет получать общее полезное увеличение до 1000000 раз.

Устройство электронного микроскопа в принципе аналогично светооптическому микроскопу, но роль световых лучей в электронном микроскопе играет пучок электронов, излучаемых специальным источником – электронной пушкой. Электроны попадают в магнитную конденсорную линзу. Использовать стеклянные линзы или зеркала для фокусировки электронов нельзя, так как стекло непроницаемо для электронов. В электронном микроскопе роль линз выполняет круговое магнитное поле, под действием которого электроны могут отклоняться или центрироваться. Функция конденсорной линзы электронного микроскопа аналогична выполняемой конденсором обычного микроскопа – сведение пучка электронов в одной точке на объекте. Пройдя через объект, электроны попадают в объектную линзу, которая вновь фокусирует расходящийся пучок и дает первое промежуточное изображение объекта. Магнитный проектор (проекционная линза, аналогичная по функции линзе окуляра) дает окончательное увеличение изображения объекта на флюоресцирующем экране – металлической пластинке, покрытой тонким слоем сернистого цинка или минерала виллемита. При попадании на экран электронных лучей каждая частица этого слоя начинает светиться; замещая экран фотографической пластинкой, изображение объекта можно сфотографировать.

На сегодняшний день электронные микроскопы бывают трех видов: трансмиссионные (просвечивающие), сканирующие и электронные микроскопы высокого напряжения. В последних большое ускорение электронов позволяет им проходить через сравнительно толстые срезы (1…5 мкм), при этом получают трехмерное изображение структур, что облегчает изучение объекта. Сканирующие электронные микроскопы обеспечивают рельефное изображение поверхности объекта. Разрешающая поверхность этих приборов значительно ниже, чем у электронных микроскопов «просвечивающего типа».

Препараты для электронно-микроскопических исследований помещают на специальные сетки, на которые нанесена тончайшая целлюлозная или пластмассовая пленка  подложка. Для увеличения контрастности объекта проводят его напыление тяжелыми металлами (хромом, золотом, палладием) в виде паров или проводят обработку контрастирующими веществами (фосфорно-вольфрамовая кислота).