2. Методы определения параметров токсикометрии

В зависимости от цели токсиикометрические исследования проводятся по-разному, но для решения задач гигиенической регламентации методические приемы, условия проведения и оценка результатов унифицированы.

Исследование токсичности веществ начинается с изучения смертельных эффектов в острых опытах. Проникновение веществ в организм осуществляет­ся при вдыхании (ингаляционный путь), введении в желудок, нанесении на кожные покровы и слизистые оболочки. Для изучения сравнительной токсич­ности соединение вводится внутрибрюшинно. В опытах на животных (белые крысы массой 180-240 г, белые мыши массой 18-29 г) определяют концентра­цию (дозу), вызывающую гибель 50 % стандартной группы подопытных жи­вотных. CL₅₀ и DL₅₀ являются статистическими величинами со средней ошиб­кой и доверительными интервалами. В связи с этим в каждой группе количе­ство животных должно быть не менее 6, желательно обоего пола и двух видов. Токсичность вводимого вещества в известной степени зависит от ряда факто­ров (концентрации и объема вводимого вещества, рН, температуры окружаю­щей среды и др.). Поэтому каждый путь поступления соединений в организм требует определенных условий.

При оценке степени токсичности при энтеральном пути поступления наиболее часто вещество вводится непосредственно в желудок с помощью ме­таллических или пластмассовых зондов. Введение соединений производится через 3 ч после кормления, вводимый объем не должен превышать для мышей 1 мл, для крыс - 5 мл. Кормление животных осуществляется через 3 ч после введения вещества. Изучаемое соединение вводится в чистом виде. Если это невозможно, то используются растворители. Обычно такие вещества вводятся в водных растворах, плохо растворимые соединения — в растительном масле, в виде суспензии в 1-2 %-м растворе крахмала. Следует помнить, что острая токсичность может существенно меняться в зависимости от используемого растворителя. Поэтому используемый растворитель обязательно вводится кон­трольной группе животных.

Поступление вредных химических веществ через дыхательные пути в производственных условиях играет ведущую роль в возникновении профес­сиональных заболеваний (отравлений). В лабораторных условиях используют­ся два способа ингаляционного воздействия на лабораторных животных хими­ческими веществами - статический и динамический.

Статический способ используется для ориентировочных оценок степени токсичности летучих веществ при создании постоянной концентрации в замк­нутом пространстве (специальные камеры или эксикаторы). Срок экспозиции для мышей -2 ч, для крыс, морских свинок, кроликов -4 ч. Основными не­достатками данного метода являются быстрое накопление в невентилируемом пространстве углекислого газа, трудности в поддержании концентрации в ка­мере на расчетном уровне.

Динамический способ позволяет обеспечить непрерывную подачу веще­ства в камеру, что создает условия для поддержания концентрации соединения на относительно постоянном уровне и обеспечивает необходимый воздухооб­мен.

Наряду с определением параметров токсикометрии на смертельном уров­не, позволяющем определить токсичность и опасность вещества, установить видовую и половую чувствительность, большое прикладное значение имеют такие параметры острой токсичности, как пороги вредного воздействия при однократном поступлении по интегральным (неспецифическим) и специфиче­ским показателям (Lim_{ac int} и Lim_{ac sp}).

Определение порога острого действия при однократном воздействии по изменению интегральных показателей проводится с использованием не менее 12 мелких лабораторных животных на одну концентрацию (дозу), как правило, применяется не менее трех концентраций. Оценка функционального состояния экспериментальных животных проводится через 4 ч после затравки, а затем на 2-й, 4-й и 8-й день опыта. При этом учитываются максимальные отклонения величины исследуемого показателя. Определение порога вредного действия по большинству специфических показателей регламентируется методическими указаниями, утвержденными Минздравом России.

В производственных условиях наряду с энтеральным и ингаляционным путями возможно поступление химических веществ через кожные покровы - перкутантный путь. В практическом плане большое значение имеет опреде­ление кожно-резорбтивного и раздражающего действия. Предварительная оценка кожно-резорбтивного действия производится на мелких лаборатор­ных животных путем погружения хвоста на 2/3 длины в исследуемый раствор. Экспозиция для белых мышей -2 ч, крыс -4 ч. При отсутствии симптомов интоксикации аппликации веществ продолжаются в течение 10 дней с после­дующим наблюдением на протяжении 3-х недель. При наличии резорбтивного действия производится количественная оценка степени токсичности. С этой целью животные фиксируются на специальном станке и на заранее выстри­женный участок кожи наносят исследуемое соединение в определенной дозе. В зависимости от поставленной задачи при исследовании кожно-резорбтивного действия могут быть определены средняя смертельная концен­трация или величина порога.

Исследование местного раздражающего действия при аппликации на кожу проводится на двух видах экспериментальных животных. Используются кролики и морские свинки светлой масти.

Количество животных - не менее 10 особей в группе. Участок апплика­ции составляет для кроликов 7x9 см, для морских свинок 5x5 см. За два дня до эксперимента тщательно выстригают участки шерсти по обе стороны от позвоночника, оставляя шерстяной покров между участками шириной 2 см. Правый бок служит для аппликации, левый - для контроля. На время экспозиции животных фиксируют для исключения слизывания вещества с кожи. Время экспозиции -4 ч. Исследуемое вещество наносится на кожу из расчета 20 мг/см². Как правило, соединение наносят на кожу в чистом виде. Если это невозможно, то используют дистиллированную воду или модельную среду, имитирующую состав потовой жидкости. Оставшееся после окончания эксперимента вещество удаляется теплой водой с мылом. Реакцию кожи реги­стрируют через 1 и 15 ч после однократной аппликации. Функциональные на­рушения кожи характеризуются появлением выраженных в разной степени эритемы, отека, трещин, изъязвлений, а также изменением температуры кожи. Степень выраженности раздражающего действия вещества на кожные покровы определяют по классификации, включающей 11 классов (0 - отсутствие дейст­вия, 10 - растворы вещества слабее 5 % вызывают некроз).

Исследование местного действия вещества на слизистую оболочку гла­за проводится при закапывании в конъюктивальный мешок 1 капли соедине­ния. Твердые вещества вносят в количестве 50 мг (дисперсность частиц до 10 мкм). В дальнейшем в течение двух часов наблюдают за прозрачностью ро­говицы и слизистой оболочки. Развитие помутнения роговицы, острое воспа­ление слизистой оболочки с последующим рубцеванием век свидетельствует о наличии у вещества резко выраженного раздражающего эффекта.

В условиях подострого (на протяжении месяца) эксперимента проводят исследования, направленные на выявление наиболее чувствительных к воздей­ствию токсичных веществ органов и систем экспериментальных животных. Это позволяет более адекватно подойти к выбору концентраций при проведе­нии хронического эксперимента. Опасность токсичных веществ для человека в значительной мере предопределяется их способностью к кумуляции, поэтому изучение кумуляции является обязательным условием при гигиеническом рег­ламентировании химических соединений. Наиболее распространенные в про­мышленной токсикологии методы оценки кумуляции основаны на определе­нии усредненного суммарного количества вещества, полученного животным до появления определенного эффекта в подостром опыте, и сопоставлении этого количества с однократной средней эффективной дозой.

В настоящее время в токсикологии принято несколько методов оценки кумуляции. С помощью метода, предложенного Каганом, животным ежеднев­но вводят вещество в долях от установленной DL₅₀ (1/5, 1/10, 1/20, 1/200). Данный метод позволяет прогнозировать опасность развития хронического от­равления. Опыт по развернутой схеме продолжается 4 месяца. Более быстрым является тест "субхронической интоксикации". Тест проводится в течение 24 дней. Первоначально ежедневная доза, составляющая 0,1 от установленной ранее DL₅₀, вводится в течение первых четырех дней. На пятые сутки дозу по­вышают в 1,5 раза и вводят еще в течение четырех дней и так далее. Затем оп­ределяют Сcum.

Более полная информация о кумулятивной активности соединений, разви­тии хронической интоксикации при воздействии химических веществ может быть получена при постановке длительных экспериментов.

Целью хронического (5-месячного эксперимента) является изучение характера влияния на организм вредных веществ и установление Lim_ch.

Исследование хронического действия проводится на одинаковых по коли­честву опытных группах с соответствующим контролем. Опыты проводят на белых крысах, а при выраженных межвидовых различиях и на более чувстви­тельном виде животных. Воздействие соединением осуществляется "4 ч в день 5 раз в неделю на протяжении четырех месяцев; пятый месяц- период восста­новления. Как правило, проводится исследование трех концентраций с уста­новлением пороговой и недействующей. В зависимости от типа действия ве­щества применяют комплекс функциональных, биохимических, морфологиче­ских и других показателей. Каждый показатель исследуют не менее чем на 12 животных. Оценка состояния экспериментальных животных проводится в динамике: первое обследование - через 2 недели, далее - ежемесячно.