Выделение вирусов из биологических материалов

Чаще всего вирусы выделяют из патологических мате­риалов в культурах клеток и куриных эмбрионах, реже их культивируют в организме экспериментальных животных.

Выделение вирусов в культурах клеток. В большин­стве случаев вирусы человека и животных выделяют на

Рис. 110 Культура клеток:

а -нормальный рост; б-ЦПД вируса

первичных культурах почек эмбрионов человека и обезьян или же на перевиваемых культурах клеток HeLa, Нер-2, KB, Vero, FL. При этом исследуемым материалом заража­ют лишь те из них, в которых под малым увеличением микроскопа наблюдается хороший рост клеток. Отсосав питательную среду, в каждую пробирку или флакон вно­сят по 0,1-0,2 мл материала, предварительно обработан­ного антибиотиками. После 30-60-минутного контакта материала с клетками его удаляют, покрывают свежей пи­тательной средой и помещают в ультратермостат.

О размножении вирусов в монослое судят по цитопатическому действию (рис. 110), выражающемуся в округле­нии и сморщивании клеток (пикорнавирусы), нарастаю­щей деструкции пласта (герпесвирусы), нередко с перво­начальной пролиферацией клеток (поксвирусы). Пикор­навирусы, герпесвирусы, многие тогавирусы, буньявиру-сы, разрушая монослой, образуют под агаровым покрыти­ем бляшки («стерильные пятна»), каждая из которых представляет собой обособленную колонию вируса. При размножении некоторых вирусов образуются многоядер­ные клетки (парамиксовирусы, герпесвирусы). Целый ряд вирусов в цитоплазме и ядре формируют внутрикле­точные включения округлой формы. Онкогенные вирусы вызывают трансформацию нормальных клеток в злокаче­ственные, чему нередко предшествуют хромосомные из­менения в ядрах монослоя. Пораженные инфекционными вирусами клетки обычно содержат огромное количество незрелых вирионов и их антигенов, которые выявляют с помощью флюоресцирующих антител. Если вирусы имеют большие размеры и, размножившись, отпочковывают­ся от клеток, то в содержимом клеточного пласта под им­мерсионным микроскопом, как уже отмечалось, удается обнаружить зрелые вирусные частицы.

Размножение вирусов, не обладающих цитопатическим действием (ЦПД), можно установить с помощью реакции гемадсорбции, проявляющейся скучиванием добавленных эритроцитов на инфицированных клетках (рис. 111) вслед­ствие наличия у многих вирусов гемагглютининов (миксовирусы, тогавирусы). Гемагглютинацию можно увидеть и невооруженным глазом на предметном стекле, прибавив к капле культуральной жидкости соответствующие эрит­роциты (рис. 112). Например, миксовирусы гемагглюти-нируют эритроциты 0 группы человека, а 60 % тогавирусов - эритроциты гусей. Ряд вирусов можно выявить по феномену интерференции, т. е. способности подавлять ЦПД другого вируса (вирусы лейкоза птиц интерфериру­ют с вирусом саркомы Рауса). При этом, правда, надо иск­лючить явление аутоинтерференции.

Выделение вирусов в курином эмбрионе. Для выделения вирусов из материалов используются, главным образом, 7-11-дневные эмбрионы белых кур. Заражение произво­дят на хорионаллантоисную оболочку (ХАО), в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок и тело

зародыша (рис. 113). При этом выбор пути инфицирования определяется специфическими свой­ствами вирусов.

Перед заражением яйцо поме­щают в овоскоп и, установив жиз­неспособность эмбриона и грани­цы воздушного мешка, спиртом и йодом обрабатывают над ним скорлупу. Наиболее распростра­нен путь введения материала на ХАО. Для этого сбоку от воздуш­ного мешка ножницами снимают скорлупу и слегка надрывают скорлупную оболочку. Вслед­ствие давления воздуха ХАО за­падает, и на нее шприцем наносят 0,1-0,2 мл исследуемого материа­ла. Прокалывая ХАО и погружая иглу на 1-2 мм, тем же количест­вом материала заражают аллантоисную полость. Для введения материала в амниотическую полость сложенными бран-шами пинцета осторожно прокалывают хорионаллантоис, захватывают амниотическую оболочку, приподнимают и после введения в ее полость 0,05-0,10 мл материала, опус­кают. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным по­кровным стеклом или стеклянным колпачком и заливают парафином.

С меньшей долей вероятности в амниотическую по­лость удается ввести вирусный материал через прокол в центре тупого конца яйца, ориентируясь на местоположе­ние эмбриона по его тени на скорлупе. Таким путем отно­сительно легко удается заразить эмбрион в желточный мешок, поместив яйцо на подставку тупым конусом впра­во и погружая иглу шприца на 3-4 см вглубь. Попав в желточный мешок, в него вводят 0,2-1,0 мл материала. Отверстие в скорлупе заливают каплей парафина.

Зараженные эмбрионы помещают в термостат, в кото­ром поддерживается определенная влажность. Время ин­кубации эмбрионов и температурный режим зависят от свойств исследуемого вируса. Так, ортомиксовирусы необ­ходимо культивировать при температуре 33 °С, возбуди­тель натуральной оспы — не выше 38,5 °С и, как исключе­ние, вирус вакцины - при 40 °С. Размножаясь в курином эмбрионе, вирусы на ХАО вызывают появление белесова­тых куполообразных бляшек (поксвирусы), задержку раз­вития и его гибель (тогавирусы), накопление в эмбрио­нальных жидкостях гемагглютининов и других антигенов (орто- и некоторые парамиксовирусы).

При вскрытии эмбрионов материал забирают в следую­щем порядке: 1) отсасывают аллантоисную, затем амнио­тическую жидкость; 2) разрезают ХАО и содержимое всего яйца выливают в чашку Петри; 3) отделяют амниотичес­кую оболочку, эмбрион и желточный мешок, захватив его за пупочный канатик; 4) последней извлекают ХАО. При этом пытаются обнаружить макроскопические изменения на хорионаллантоисной и амниотической оболочках.

Выделение вирусов в организме животных. В организ­ме животных культивируют те вирусы, которые плохо или совсем не размножаются в культурах клеток и кури­ном эмбрионе. При этом, выделяя коксаки-, тога- и арена-вирусы, материалом предпочтительнее заражать мышей-сосунков, а в случаях, требующих выделения онкогенных вирусов, - сосунков белых крыс и сирийских хомяков.

Количественный выход (титр накопления) вирусов в организме животных во многом зависит от их тропизма и, следовательно, от путей инфицирования, определяющих возникновение и развитие вирусной инфекции. Поэтому, выделяя нейротропные вирусы (рабдо-, тога-, буньявиру-сы), патологический материал надо вводить под твердую мозговую оболочку или в вещество головного и спинного мозга. Респираторные вирусы выделяют путем интрана-зального заражения наркотизированных белых мышей (ортомиксовирусы), инокуляцией содержимого носоглот­ки в слизистую оболочку защечных мешков сирийских хомяков (аденовирусы), введением содержимого везикул в скарифицированную кожу и конъюнктиву глаза кроли­ков и морских свинок (покс- и герпесвирусы).

Отдельные вирусы вызывают у животных развитие ха­рактерных параличей (лисса- и тогавирусы); специфичес­кие патогистологические изменения в тканях, например в межлопаточном буром жире (пикорна- и тогавирусы); об­разование папул и везикул на коже и коньюнктиве глаза (поксвирусы) и другие проявления.

Изучив патогенные эффекты вирусов в клеточном моно­слое, курином эмбрионе и организме животного, выделен­ный вирус на заключительном этапе вирусологического ис­следования идентифицируют в серологических реакциях.