Биохимический и генетический аспекты антибиотикорезистентности

Причина устойчивости микроорганизмов к антибиотикам связана с пластичностью метаболизма прокариот. Микроорганизмы очень легко и быстро вырабатывают средства защиты против антибиотиков, ядов, токсинов, тяжелых металлов и других веществ. Появление резистентных форм снижает эффективность лечения.

Штамм считается устойчивым, если микроорганизм растет на средах с антибиотиком в концентрации, равной МПК для чувствительного штамма.

Различают штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и перекрестной устойчивостью. Множественная – это такой тип устойчивости, при которой один и тот же штамм проявляет устойчивость к двум и более антибиотикам разных классвов. Например, St.aureus Pn^R Cm^R Em^R. Перекрестная – это такой тип устойчивости к двум и более антибиотикам, которые принадлежат к одной группе. Эта устойчивость обусловлена идентичными механизмами раелизации.

Развитие устойчивости микроорганизмов к антибиотикам происходит по типу одноступенчатой или многоступенчатой устойчивости. Одноступенчатая – «все или ничего»; формируется устойчивость к высоким концентрациям антибиотика (например, устойчивость к стрептомицину). Многоступенчатая – постепенное формирование устойчивости (например, к пенициллину).

Проблему устойчивости рассматривают с двух аспектов:

1. биохимический (позволяет изучить механизмы клеток, которые позволяют микроорганизмам приобретать устойчивость)

2. генетический (позволяет объяснить роль генома к формированию резистентности).

Основные биохимические механизмы антибиотикорезистентности:

- уменьшение проницаемости бактериальной клетки для антибиотика

- ферментное разрушение или модификация антибиотика за счет конститутивных ли индуцибельных ферментов

- модификация мишени, на которую действует антибиотик

- способность клетки снижать концентрацию антибиотика внутри клетки за счет активного его выброса

- увеличение образования фермента, на который действует антибиотик

- появление нового метаболического пути в дополнение к тому, на который действует антибиотик.

Изменение мембранной проницаемости

Антибиотик поступает внутрь клетки путем пассивной диффузии или активного транспорта (с использованием энергии). Барьеры: цитоплазматическая мембрана и наружная мембрана Г- микроорганизмов. Реализация этого механизма может быть связана с двумя аспектами:

1. изменение белков-поринов (уменьшение диаметра пор), в результате чего антибиотик не может быть транспортирован внутрь клетки

2. изменение свойств специфического белка-переносчика антибиотика (в случае активного транспорта).

Эти механизмы реализуются благодаря мутациям.

Ферментативное разрушение или модификация антибиотика

Связан с наличием у антибиотикорезистентного штамма способности к синтезу фермента, разрушающего или модифицирующего антибиотик – образуется неактивная с точки зрения биологической активности антибиотическое вещество.

К таким ферментам относятся b-лактамазы (разрушают b-лактанное кольцо пенициллинов и цефалоспоринов).

Существует несколько принципов классификации b-лактамаз: по субстратному принципу, по локализации детерминант ферментов (хромосомная, плазмидная или транспозонная).

Выделяют три группы:

- класс А (b-лактамазы Г+ бактерий, которые в активном центре содержат сериновый остаток)

- класс В (b-лактамазы, которые продуцируют бациллярные Г+ микроорганизмы, которые требуют в качестве кофактора ионы цинка)

- класс С (b-лактамазы Г- микроорганизмов, которые имеют хромосомную локализацию).

Но более удобна классификация Ричмонда:

1. b-лактамазы, которые гидролизируют цефалоспорины

2. b-лактамазы, которые гидролизируют пенициллины

3), 4), 5) - b-лактамазы, которые имеют широкий субстратный профиль.

Микроорганизмы, которые относятся к разным родам, образуют b-лактамазы с разной субстратной специфичностью. Так, стафилококки образуют b-лактамазы, разрушающие пенициллин. Отдельные штаммы E.coli, клинические формы Proteus vulgaris могут разрушать как пенициллины, так и цефалоспорины. b-лактамазы микроорганизмов рода Pseudomonas имеют широкий спектр действия.

По мнению ряда авторов, устойчивость к антибиотикам определяется с одной стороны количеством b-лактамаз, а с другой стороны из локализацией (при поверхностной устойчивость более ярко выраженная, чем при внутриклеточной локализации).

Образование b-лактамаз кодируется хромосомными или плазмидными генами.

Для преодоления действия b-лактамаз вместе с антибиотиком необходимо вводить ингибиторы b-лактамаз; необходимо заключать антибиотик в липосому, которая будет его защищать от действия b-лактамаз.

Существуют и другие ферменты, например, ацетил-трансферазы, который инактивируют антибиотики в результате переноса ацетильной группы от молекулы-донора на молекулу антибиотика. В результате такого ацетилирования образуется неактивная форма антибиотика. Такой механизм реализуется в отношении хлорамфеникола (левомицетина).

Следующая группа ферментов – гидролазы. Это ферменты, гидролизирующие хлорамфеникол по месту амидной связи с образованием неактивной формы антибиотика – нитрофенилсеринола.

Фосфотрансферазы – инактивируют антибиотик в результате включения в его структуру фосфорной связи.

Аденилтрансферазы – переносят на антибиотик остаток адениловой кислоты, в результате чего антибиотик инактивируется.

Ферменты могут быть конститутивными или индуцибельными.

Модификация мишени, на которую действует антибиотик

Антибиотик действует только тогда, когда он проникнет внутрь клетки и свяжется с мишенью (ферменты синтеза тех или иных веществ или другие структуры). Устойчивость: нарушение структуры соответствующих ферментов – мишеней. Эта структура может быть изменена вследствие изменения последовательности аминокислот с сохранением ферментативной активности.

Пример: изменение пенициллин-связывающего белка (ПСБ), который является множественными формами транспептидаз и карбоксипептидаз.

У каждого рода микроорганизмов свой набор этих ферментов.

Активный выброс антибиотика из клетки

Реализуется у штаммов, устойчивых к тетрациклину. Антибиотики накапливаются в клетках, поступают путем механизма активного транспорта и используют для этого транспортные системы для некоторых аминокислот. Но как только концентрация антибиотика становится угрожающей для клетки, микроорганизм начинает выбрасывать его из клетки, используя те же транспортные системы.

Увеличение образования фермента-мишени

Микроорганизм начинает усиленно синтезировать фермен-мишень. Обычно такой механизм реализуется среди микроорганизмов, устойчивым к антиметаболитам.

У микроорганизмов может одновременно проявляться несколько механизмов антибиотикорезистентности. Так, устойчивость к пенициллину связана с образованием b-лактамаз, изменением структуры ПСБ, с барьерными функциями наружной мембраны клеточной стенки Г- бактерий.

Приобретение устойчивости к пенициллинам сопровождается резистентностью к близкородственным антибиотикам.

Резистентность к тетрациклинам формируется медленно и относится к многоступенчатому типу. Формируются в основном два механизма: снижение поглощения антибиотика из среды и активный выброс антибиотика из клетки, ферментная деградация (сейчас обсуждается).

Хлорамфеникол: модификация структуры антибиотика под действием фермента, непроницаемость мембраны для антибиотика, изменение мишени действия.

Генетические аспекты антибиотикорезистентности

Существует два типа устойчивости: природная (определяется свойством данного конкретного микроорганизма, в его основе – эволюционное развитие (филогенез)) и приобретенная (онтогенетическое развитие – индивидуальное развитие организма).

Приобретенную устойчивость можно разделить на мутационную и возникшую в результате генетической рекомбинации.

Механизм приобретенной устойчивости до конца не изучен. Чаще всего у низ просто нет структур, на которые действуют антибиотики. Например, микоплазмы обладают природной устойчивостью к b-лактанным антибиотикам, аналогично – простейшие.

Приобретенная устойчивость связана с изменением генома бактериальной клетки в результате мутаций или рекомбинаций. Вклад мутации в механизм приобретенной устойчивости к антибиотикам незначителен, так как мутации происходят с очень низкой частотой (10^-6…10^-9 к одному антибиотику. Возможность множественных мутаций еще ниже. Кроме того, мутации являются неблагоприятными для развития микроорганизма и часто ведут к гибели клетки. Поэтому с эволюционной точки зрения накопление хромосомных мутаций вряд ли может быть основной причиной появления полирезистентности бактерий.

Наиболее распространенной генетической основой устойчивости бактерий к антибиотикам является наличие дополнительной экстрахромосомной ДНК. То есть, резистентность к антибиотикам у микроорганизмов связана с наличием таких внехромосомных факторов наследственности, как плазмиды (эписомы) и транспозоны. Инсерционные фрагменты не обладают кодирующей функцией и не могут кодировать признаки антибиотикорезистентности. Прежде всего, все эти факторы различаются молекулярной массой и объемом закодированной в них информации. Ни один из внехромосомных факторов не является жизненно важным для клетки. Вместе с тем эти факторы расширяют норму реакции клетки и придают ей селективные преимущества.

Плазмиды и эписомы

По химической природе – двухцепочечная ДНК, которая содержит около 100 генов. Встречаются мелкие и крупные плазмиды, они встречаются в нескольких копиях на хромосому (чем мельче плазмида, тем больше копий).

Существует три вида плазмид: линейные, кольцевые структуры с ковалентно замкнутыми концами и релаксированые формы плазмид (одна цепь ковалентно замкнутая, а другая имеет один или несколько разрывов).

Характерны следующие свойства: находятся вне хромосомы клетки-хозяина, имеет свой собственный репликон (реплицируется автономно от хромосомы хозяина), передаются между клетками посредством определенных механизмов (коньюгация, трансдукция), а также могут быть самотрансферабельными (могут обеспечивать свой собственный перенос). Плазмиды, которые способны встраиваться в хромосому хозяина, называют эписомами. Они имеют собственный репликон, но во встроенном состоянии эписомы реплицируются синхронно с бактериальной хромосомой. Встраивание происходит только в определенные участки ДНК (строго специфичные локусы). В отличие от плазмид, эписомы могут выполнять не только кодированную функцию, но могут выполнять и регуляторную функцию. Если эписома встраивается в дефектный геном, который не может реплицироваться, то репликон эписомы может быть инициатором репликации ДНК.

Встроенная плазмида может переходить в автономное состояние, и это связано с факторами внешней среды или внутриклеточными факторами.

Классификация плазмид:

1. По способности к трансмиссии (коньюгативные – обеспечивают свой собственный перенос и способны переносить неконьюгативные плазмиды; неконьюгативные плазмиды – не способны самостоятельно переноситься, но могут переноситься трансмиссивными факторами – коньюгативными плазмидами и бактериофагами).

2. Деление плазмид по типу несовместимости. При одном типе несовместимости одна плазмида подавляет репликацию другой. Это связано с тем, что у плазмид, принадлежащих к одной группе несовместимости, имеется один и тот же участок на цитоплазматической мембране, который инициирует репликацию плазмиды.

3. По фенотипу (проявление плазмиды): R-факторы (резистентности), f-плазмиды и ее варианты, криптические плазмиды (единственные, которые фенотипически не проявляются), пеницилиназные плазмиды стафилококков и Col-факторы (плазмиды бактериоциногении). В антибиотикорезистентности принимают участие только R-плазмиды и пеницилиназные плазмиды.

R-плазмиды

Плазмиды резистентности к антибиотикам, ядам и токсическим продуктам; к лекарственным препаратам.

По химичиской природе – двухцепочечные ДНК, которые могут находиться в нескольких формах (линейная, кольцевая, релаксированная). Среди этих типов есть трансмиссивные коньюгативные (обеспечивают свой перенос, самотрансферабельные), а также плазмиды неконьюгативные (передаются посредством коньюгативных факторов – плазмид, вирусов, ДНК).

Среди R-плазмид встречаются плазмиды как в широком смысле, так и эписомы – встраиваются в ДНК генома клетки.

Имеют сложное строение, состоят из двух частей:

1) RTF-фактор – компонент, который обеспечивает перенос плазмиды и этот фактор обладает собственным репликоном (обеспечивает себе репликацию), но не имеет фенотипического проявления – нет кодирующей функции, нет резистентности

2) один или несколько последовательных соединений r-детерминант – собственный репликон, могут реплицироваться, не в состоянии предаваться без RTF-фактора, не могут себя переносить – их кодирующая функция – резистентность к различным веществам, тип устойчивости – ферменты, разрушают или диссоциируют.

RTF – больше, чем одна r-детерминанта. Разная у ДНК плавучая плотность и разное содержание ГЦ-оснований. Разное эволюционное происхождение.

R-плазмиды могут самостоятельно диссоциировать на независимо существующие RTF и отдельные детерминанты (самостоятельно реплицируются).

Стабильность комплекса зависит от самого r-фактора (от его природы) и от клетки-хазяина. Многие крупные R-плазмиды ведут себя как f-(половые) плазмиды и способны детерминировать образование R-пилей.

R-плазмиды объединяются по типам несовместимости; в пределах одного класса несовместимости репликация одной плазмиды подавляется другой группой плазмид. Многие факторы можно подразделить на классы несовместимости.

Плазмиды, относящиеся к одной группе несовместимости, детерминируют одинаковые в химическом отношении половые ворсинки и их ДНК содержат гомологичные последовательности оснований.

R-плазмиды могут сочетать в себе устойчивость сразу к нескольким химиотерапевтическим препаратам.

Пенициллиназные плазмиды

У стафилококков (R-плазмиды у стафилококков кодируют только синтез пенициллиназ).

Они кодируют устойчивость за счет синтеза пенициллиназ (b-лактамаз).

В зависимости от типа пенициллиназ, которые кодируют эти плазмиды, они –  … - среди них есть плазмиды, есть в встроенном состоянии и эписомы.

Характерные – неконьюгативные, могут переноситься посредством фагов или коньюгативных плазмид.

Транспозоны

Гораздо меньше, 2-20 генов, как и некоторые плазмиды – инф., необходимые для транспозиции (обеспечивают свой перенос), выполняют кодирующую функцию (фенотипическое проявление), встраиваются в любые генетические элементы – репликаторная функция.

Могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы ДНК и не содержат собственного репликона – не способны в этом состоянии к репликации.

Реплицируются тогда, когда находятся в структуре бактериальной хромосомы или другого генетического материала, которые способны к репликации (плазмиды).

В отличии от плазмид (эписом), которые могут встраиваться в определенные участки в бактериальной хромосоме (один или несколько, но определенные), транспозоны встраиваются в любой участок бактериальног огенома или другого репликона. Легко встраиваются в любой репликон.

От одного репликона – в другой: важное свойство транспозонов. Легко отличить – на концах специфические маркеры (особые структуры).

Встречаются у всех представителей живого мира, включая человека.

Являются генными мутаторами.

Генетическая рекомбинация

Огромную роль в передаче лекарственной устойчивости в природе играют генетические рекомбинации бактерий.

Под рекомбинацией понимают внесение части генетического материала одного из родительского штамма (донора) к другому родительскому штамму (реципиенту), образованный в результате этого рекомбинант имеет признаки обоих родителей, при этом основной набор генов реципиента и определенная часть генов донора .

Выделяют три механизма генетической рекомбинации:

1) трансформация – это процесс образования рекомбинанта в результате обработки клеток реципиента молекулами ДНК, выделенными из клеток донора. При трансформации короткие фрагменты двухцепочечной ДНК, которые высвобождаются от клеток донора, собрируются на поверхности клетки, но внутрь попадает одна цепь ДНК из этого фрагмента, а другая деградирует. В природе есть – лекарственная устойчивость.

Разновидность – трансфекция (процесс, при котором в качестве донора ДНК используется вирус.

2) коньюгация – это обмен генетическим материалом в результате прямого скрещивания бактериальных фрагментов, которые переносятся из клетки в клетку. Может быть большим (даже практически все), но внутрь клетки только одноцепочечная ДНК.

3) трансдукция – процесс передачи генетического материала от клетки в клетку посредством бактериофага (умеренный – может встраиватся в геном бактериальной клетки).

При трансдукции небольшие фрагменты двухцепочечной ДНК передаются от клетки донора к клетке реципиента фаговой частицой.