31. Принципы и методы выделения чистых культур аэробов.

32. Принципы и методы выделения чистых культур анаэробов.

Методы культивирования анаэробов.

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать условия анаэробиоза, т. е. пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве. Это достигается применением физических, химических и биологических методов.

Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред;

3) механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо индифферентным газом.

В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (около 0,5 г) животных или растительных тканей (печень, мозг, почки, селезенка, кровь, картофель, вата). Эти ткани связывают растворенный в среде кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством стерильного вазе¬линового масла. Высота слоя масла в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ используют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая используется с успехом для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

Посев микроорганизмов в глубину плотных сред про¬изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Берут стеклянную трубку длиной 30 см и диа¬метром 3—6 мм. Один конец трубки вытягивают в ка-пилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 50°С питательным агаром засевают исследуемый материал. Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капилляр¬ный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Для выде¬ления отдельной колонии трубку надрезают напильни¬ком, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ло¬мают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальней¬шего выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем его механическо¬го откачивания из специальных приборов — анаэроста-тов, в которые помещают чашки с посевом анаэробов. Переносный анаэростат представляет собой толстостен¬ный металлический цилиндр с хорошо притертой крыш¬кой (с резиновой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом (азотом, во¬дородом, аргоном, углекислым газом) можно производить в тех же анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы. Основаны на поглощении кисло¬рода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэро-стате, эксикаторе) такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия Na2S204.

Биологические методы. Основаны на совместном вы¬ращивании анаэробов со строгими аэробами. Для этого из застывшей агаровой пластинки по диаметру чашки вырезают стерильным скальпелем полоску агара шири¬ной около 1 см. Получается два агаровых полудиска в одной чашке. На одну сторону агаровой пластинки засе¬вают аэроб, например часто используют S. aureus или Serratia marcescens. На другую сторону засевают ана¬эроб. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином и помещают в термостат. При наличии подходящих условий в чашке начнут размно¬жаться аэробы. После того, как весь кислород в прост¬ранстве чашки будет ими использован, начнется рост анаэробов (через 3—4 сут). В целях сокращения воздуш-ного пространства в чашке питательную среду наливают возможно более толстым слоем.

Комбинированные методы. Основаны на сочетании фи¬зических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

№ 33. Искусственные питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содер¬жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или рас-тительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины груп¬пы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про-исхождения с добавлением неорганических солей, угле¬водов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды могут быть жид¬кими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до¬бавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо¬бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застыв¬шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сы¬воротка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференци¬ально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пита¬тельный агар. Такие среды служат основой для приготов¬ления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак¬терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира¬тельного выделения и накопления микроорганизмов определен¬ного вида (или определенной группы) из материалов, содержа¬щих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особен¬ностей, которые отличают данные микроорганизмы от большин¬ства других. Например, избирательный рост стафилококков на¬блюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, хо¬лерного вибриона — в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при¬меняются для разграничения отдельных видов (или групп) мик¬роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи¬мической активности вследствие неодинакового набора фермен¬тов.

Особую группу составляют синтетические и полусинтетиче¬ские питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследова¬тельской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и уско¬ренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так на¬зываемые микротест-системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся сте¬рильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Любая питательная среда должна отвечать следующим тре¬бованиям: содержать все необходимые для размножения микроорганизмов вещества в легкоусвояемой форме; иметь оптимальные влажность, вязкость, рН, быть изотоничной и по воз¬можности прозрачной. Каждую питательную среду стерилизуют определенным способом в зависимости от ее состава.

№ 33. Методы культивирования вирусов и риккетсий.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей живот¬ных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывает¬ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен¬ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра¬няются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготов¬ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю¬щих способностью длительно размножаться in vitro в определен¬ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам¬ниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоид¬ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе¬му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу¬емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло¬качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опу¬холевых.

О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), кото¬рое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток.

Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорби¬ровать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее по¬становки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На по¬верхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Другой метод — реакция гемагглютинации (РГ). Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жид¬кости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6—7-дневной инку¬бации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса при¬нимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных ви¬русных частиц является метод бляшек.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно вы¬сокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздей¬ствиям.

Для получения чистых культур риккетсий, хламидий. и ря¬да вирусов в диагностических целях, а также для приготов¬ления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим из¬менениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его обо¬лочках.

О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность об¬наружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очист¬ку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препа¬ратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность живот¬ных к определенному вирусу и их возраст определяют репродук¬тивную способность вирусов. Во многих случаях только ново¬рожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки — к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в воз¬можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуциру¬ются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся кон¬таминация организма подопытных животных посторонними ви¬русами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данно¬го вируса, что удлиняет сроки исследования.

Методы выявления риккетсий

Риккетсии – грамотрицательные микроорганизмы малых размеров. Они занимают промежуточное положение между бактериями и вирусами. С бактериями они сходны по морфологии. Внутриклеточное размножение и паразитизм на энергетическом уровне сближают их с вирусами. Окисляют глутамат с образованием АТФ.

По величине они крупнее вирусов, не проходят через фильтры и обнаруживаются в оптическом микроскопе.

По П. Ф. Здродовскому наблюдаются 4 морфологических типа риккетсий (циклы развития риккетсии):

1)кокковидные (0,5мкм),

2)палочковидные (короткие - 1-1,5мкм),

3)бациллярные (длинные, изогнутые - 3-4мкм),

4)нитевидные (20-40мкм).

Риккетсии выявляются в окраске по методу Грама (грамотрицательные), по методу Романовского-Гимзы, по методу Здродовского и нативных препаратах (удобен и прост метод окраски риккетсий по Здродовскому)