Методика проведения пцр-реакции полиморфного локуса TaqIа в гене d2-рецептора дофамина (drd2)

Предложенный в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г. альтернативный метод анализа геномной ДНК-метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) - явился эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК-длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, реже до 1000-2000 п.о., используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК длиной обычно от 15 до 30 п.о., комплиментарными 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. В качестве матрицы для синтеза может быть использован любой тип ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов про- и эукариот; ДНК. Амплификация (ПЦР синтеза ДНК) фрагмента ДНК достигается за счет работы фермента ДНК-полимеразы, который в присутствии предшественников ДНК (дезоксинуклеотидтрифосфатов) может синтезировать на однонитевой матрице ДНК комплиментарную нить. Для начала синтеза необходима затравка - небольшой фрагмент нуклеиновой кислоты, уже присоединившийся к однонитевой ДНК. Такие затравки-праймеры можно синтезировать искусственно.

Для амплификации фрагмента используются два разных праймера, фланкирующих интересующий нас участок ДНК. Они гибридизуются на противоположных концах комплиментарных нитей данного фрагмента на некотором расстоянии друг от друга так, чтобы синтез происходил от одного праймера к другому. Цикл амплификации состоит из трех следующих стадий:

1. Денатурация, в процессе которой двунитевая ДНК разделяется на две комплиментарные цепи. Ее проводят повышением температуры до 92-96°С.

2. Отжиг , в течение которого праймеры находят свои места посадки на ДНК. Для отжига необходимы более низкие температуры. В зависимости от размера и нуклеотидного состава праймеров выбирают температуру отжига в пределах 37-65°С.

3. Синтез цепи, для которого выбирается оптимальная температура работы ДНК-полимеразы. Для наиболее часто использующихся в настоящее время термостабильных полимераз эта температура составляет 72°С (Дейвис, 1990).

В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента приблизительно по формуле 2n , где n – число прошедших циклов амплификации. Поскольку праймеры физически включаются в концы продуктов застройки, они детерминируют сам продукт реакции - фрагмент ДНК, равный по длине расстоянию между 5` - концами праймеров на исследуемом участке ДНК.

В последнее время для увеличения эффективности амплификации используют термостабильную ДНК - полимеразу, выделенную из бактерий Thermus aqaticus (Taq), которая сохраняет свою активность после тепловой денатурации ДНК, и нет необходимости заменять фермент после каждого цикла. Еще одно важное преимущество Таq-полимеразы заключается в более высоком температурном оптимуме детерминируемой ею реакции (70-75°С), что значительно повышает специфичность, количественный выход, возможную длину синтезируемых копий интересующей нас последовательности.

Анализ полиморфного локуса гена DRD2 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на термоциклере в автоматическом режиме. Для этого 1 мкл исследуемого образца геномной ДНК добавляли к 9 мкл смеси следующего состава:

1.10 % буфер – 1 мкл,

2.dNTP – 0.5 мкл,

3. Pr1 – 0.044 мкл,

4. Pr2 – 0.046 мкл,

5. Taq-полимераза – 0.15 мкл,

6. H₂O – 7.26 мкл,

7. ДНК – 1 мкл.

Праймер1: 5¢ ССGTCGACGGCTGGCCAAGTTGTCTA 3¢,

Праймер 2: 5¢ CCGTCGACCCTTCCTGAGTGTCATCA 3¢ (Grandy et al., 1989).

После денатурации (4 мин. при 95°С) выполняли 30 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 30 сек. при 78°С , синтез ДНК – 1 мин. при 72°С, денатурация - 40 сек. при 95°С. Затем пробы выдерживали 10 мин. при 72°С и охлаждали.