Использование культуры клеток человека.

Фибробласты являются основным клеточным элементом среднего слоя кожи, основная функция которых синтезировать и ресоздавать межклеточное пространство. Фибробласты синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса и ферменты, с помощью которых они разрушают коллаген и гиалуроновую кислоту, а также синтезируют эти молекулы заново. После установления лимита Хейфлика и фактов, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют низкую экспрессию антигенов гистосовместимости и отсутствие онкогенных потенций, стало возможно использование культивируемых вне организма фибробластов человека для терапевтических целей. Возможность культивирования в достаточном объеме необходимых для практики фибробластов делает реальным их клинического использования. Было показано, что пересаженные аллогенные фибробласты оказывают непосредственное влияние на заживление ран и на эпителизацию (Ross, 1968; Coulomb et el., 1989; Шумаков и др., 2002). Для лечения глубоких ожогов в 1983 году (Bell et el.) предложил «дермальный эквивалент» (аналог живой дермы, искусственно созданный из коллагена и фибробластов). Впервые была успешно использована 3-дневная культура аллогенных фибробластов для закрытия раневых поверхностей у пациентов с ожогами (Саркисов, Алексеев, 1994). Дальнейшее развитие клеточных технологий привело к появлению отдельных клинических опытов по применению пересадки клеток при витилиго, невусах, буллезном эпидермолизе, лечении хронических язв, различного рода рубцов, при удалении татуировок (Kumahai et al., 1995; Oh et al., 2001; Озерская, 2002). Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.

Стволовые клетки.

Понятие «стволовые клетки» (СК) впервые появилось в России еще в начале прошлого века. В 1908 году великий российский гистолог, профессор военно-медицинской академии в Санкт-Петербурге А.А.Максимов (1874-1928), изучая процесс кроветворения, пришел к выводу об их существовании. А.А. Максимов назвал клетку – прародительницу всех клеток крови – стволовой. В отличие от обычных клеток, стволовые клетки способны делиться неограниченное число раз. Они также сохраняют способность дифференцироваться в специализированные клетки, хотя в настоящее время еще не до конца понятно, какие факторы направляют СК по тому или иному пути дифференциации при их созревании. В ходе клеточного деления из стволовых клеток возникают материнская и дочерняя клетки. Материнские используются для самоподдержания популяции, а дочерние либо «выходят» в камбиальную клетку, либо непосредственно в дифференцировку. Стволовая клетка сохраняет свойства ранних эмбриональных клеток – плюрипотентность, а камбиальная эту способность утрачивает и производит лишь региональные структуры. Обнаружить стволовые клетки можно с помощью специальных методов (иммуногистохимической техники).

Классификация стволовых клеток по способности к дифференцировке

и источникам выделения.

• По способности к дифференциации СК классифицируют:

1. Тотипотентные клетки - способны формировать все эмбриональные и экстраэмбриональные типы клеток. К ним относятся только оплодотворенный ооцит и бластомеры 2-8 клеточной стадии.

2. Плюрипотентные клетки – способны формировать все клетки эмбриона. К ним относятся эмбриональные стволовые клетки, первичные половые клетки и клетки эмбриональных карцином. Плюрипотентные стволовые клетки были выделены из мозга, мышц, кожи, желудочно-кишечного тракта, роговицы глаза, сетчатки глаза, печени и поджелудочной железы.

3. Другие типы стволовых клеток – локализуются в сформировавшихся тканях взрослого организма (adult stem cells). Они варьируют по способности к дифференцировке от мульти- до унипотентных. Плюри (мульти - ) потентность - способность стволовых клеток дифференцироваться в несколько типов клеток различных органов. Унипотентные стволовые клетки способны образовывать только один тип дифференцированных клеток. Это означает, что они могут давать только строго определенные типы конечных дифференцированных клеток.

• По источнику выделения СК классифицируют:

1. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – внутриклеточная масса раннего эмбриона (на этапе бластоцисты 4-7 недель развития).

2. Фетальные стволовые клетки – клетки зародыша на 9-12 неделе развития, выделенные из абортивного материала.

3. Стволовые клетки взрослого организма.

В настоящее время по современной классификации к стволовым клеткам относят тотипотентные клетки морулы, плюрипотентные клетки бластоцисты, из которых в эмбриогенезе формируются все ткани организма, и мультипотентные региональные герминативные клетки (Orkin, Morrison, 2002).

Свойства СК

• 1. Неспециализированы- т.е. не имеют тканеспецифичных структур, позволяющих выполнять специализированные функции;

• 2. Способны к пролиферации – т.е. к длительному (по-видимому), больше продолжительности жизни человека размножению и продукции большого (возможно сколько угодного) числа клеток. Исходная популяция СК, которая пролифирирует в лабораторных условиях в течение нескольких месяцев, может вырасти до нескольких миллионов клеток;

• 3. Способны к дифференцировке – процессу специализации клеток. Способность ВСК дифференцироваться во многие типы клеток называется пластичностью или трансдифференцировкой.

• 4. Способны к ассиметричному делению. В результате деления специализированных клеток образуются пары таких же клеток, полностью тождественных друг другу. А для СК это правило не обязательно: они могут делиться несимметрично – только одна дочерняя клетка идентична родительской и остается стволовой, другая претерпевает цепь превращений и становится специализированной.;

5. Способствуют к регенерации. Попадая в организм при трансплантации, СК продолжают делиться, и как сейчас считается, сами находят место, где их помощь нужнее всего. Они продуцируют разнообразные БАВ, которые обновляют и регенерируют окружающие ткани

В качестве источников ВСК в медицине в настоящее время используют:

• -Костный мозг. Костный мозг чрезвычайно богат стволовыми клетками. Однако взятие образцов костного мозга представляет собой болезненную и небезопасную процедуру;

• -Слизистая оболочка носоглотки в районе обонятельных рецепторов содержит частично специализировавшиеся СК, способные превращаться в клетки нервной ткани – нейроны и клетки глии. Эти клетки, вероятно, должны быть пригодны для лечения травм и заболеваний головного и спинного мозга. Соскоб со слизистой оболочки может быть легко произведен под местным наркозом или даже без него.;

• -Жировая ткань. Жировая ткань содержит мезенхимальные СК, способные образовывать клетки жировой, хрящевой, костной и мышечной тканей. Жировая ткань может быть легко получена при липосакции. Этот источник считается весьма перспективным.

• -Плацентарная и пуповинная кровь новорожденных очень богата СК, их там даже больше, чем в костном мозге. Высокая эффективность применения этих СК продемонстрирована при гематологических заболеваниях и нарушениях иммунитета. Использование в качестве источников СК пуповинной крови имеет ряд существенных преимуществ:

  1. они намного легче собираются (это быстрая безболезненная процедура, не требующая анестезии);

  2. генетически идеально подходят ребенку;

  3. снижен риск появления реакции «трансплантат против хозяина»

  4. риск передачи инфекционных заболеваний от донора к реципиенту.

-Плацента. В 2001 г.было опубликовано сообщение, что американская фирма AnthroGen получила из человеческой плаценты значительное количество (в 10 раз больше, чем из пуповинной крови) СК, способных преобразовываться в кожные, кровяные, мышечные и нервные клетки. Если это сообщение подтвердиться, плачента окажется одним из перспективных источников СК как для ауто- так и для аллотрансплантации.