1.2. Размывание в колонке и вне ее

Вещества вводятся в колонку в виде узкой зоны, которая по мере ее движения с под­вижной фазой по колонке становится все шире, т. е. размывается в результате диффузи­онных процессов. Мерой этого размывания в колонке является высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Установлено, что размывание полосы в хроматографиче-ской колонке обусловлено тремя причинами: наличием вихревой диффузии, молеку­лярной диффузии и сопротивления массопередаче. Общая ВЭТТ (H) колонки получается путем суммирования вкладов всех этих факторов, вызывающих размывание хроматогра-фической зоны:

H = Hp + Hd + Hs + Hm,

где Нр — вклад в размывание вихревой диффузии; На — вклад в размывание молеку­лярной диффузии; Hs — вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в непод­вижной фазе; Нт — вклад, связанный с сопротивлением массопередаче в подвижной фа­зе.

Не вдаваясь в подробное рассмотрение этих вкладов в ВЭТТ, тем не менее следует заметить, что чем меньше каждое из четырех слагаемых, тем меньше будет и суммарное значение ВЭТТ и, следовательно, эффективнее колонка. Величина Нр пропорциональна диаметру частиц сорбента и уменьшается с улучшением равномерности заполнения

Рис. 1.4. Зависимость ВЭТТ от скорости подачи растворителя (V, мл/мин). Вклад в размывание пика разных факторов

колонки сорбентом. Величина Hd растет при ис­пользовании очень малых скоростей потока, при обычно используемых высоких скоро­стях Hd настолько мала, что ею можно пренебречь. Величина Нт уменьшается при уско­рении процессов адсорбции — десорбции в неподвижной фазе, т. е. при использовании частиц малого размера и тонких пленок неподвижной фазы, при уменьшении скорости потока. Величина Нт уменьшается при уменьшении размера частиц (пропорционально квадрату диаметра частиц), более равномерном и плотном заполнении колонки сорбен­том, менее вязком растворителе, меньших скоростях потока.

Если изобразить графически зависимость ВЭТТ от скорости подачи растворителя, то она будет иметь вид, изображенный на рис.1.4. На нем можно видеть и оценить вклад ка­ждой из составляющих в значение ВЭТТ.

Таким образом, размывание в колонке уменьшается и эффективность повышается, когда используют более мелкий сорбент, более равномерный по составу (узкая фракция), более плотно и равномерно упакованный в колонке, при использовании более тонких слоев привитой фазы, менее вязких растворителей и оптимальных скоростей потока.

Однако наряду с размыванием полосы хроматографической зоны в процессе разде­ления в колонке может происходить также и размывание ее в устройстве для ввода про­бы, в соединительных капиллярах инжектор — колонка и колонка — детектор, в ячейке детектора и в некоторых вспомогательных устройствах (микрофильтры для улавливания механических частиц из пробы, устанавливаемые после инжектора, пред-колонки, ре­акторы-змеевики и др.). Размывание при этом тем больше, чем больше внеколоночный объем по сравнению с удерживаемым объемом пика. Имеет также значение и то, в каком месте находится мертвый объем: чем уже хроматографическая зона, тем большее раз­мывание даст мертвый объем. Поэтому особое внимание следует уделять конструирова­нию той части хроматографа, где хроматографическая зона наиболее узкая (инжектор и устройства от инжектора до колонки) — здесь внеколоночное размывание наиболее опасно и сказывается наиболее сильно. Хотя считается, что в хорошо сконструированных хроматографах источники дополнительного внеколоночного размывания должны быть сведены до минимума, тем не менее каждый новый прибор, каждая переделка хромато­графа должны обязательно заканчиваться тестированием на колонке и сравнением полу­ченной хроматограммы с паспортной. Если наблюдается искажение пика, резкое сниже­ние эффективности, следует тщательно проинспектировать вновь введенные в систему капилляры и другие устройства.

Размывание вне колонки и его неправильная оценка могут привести к значительной (более 50%) потере эффективности, особенно в тех случаях, когда относительно давно сконструированные хроматографы пытаются использовать для высокоскоростной ВЭЖХ, микроколоночной ВЭЖХ и других вариантов современной ВЭЖХ, требующих микроин­жекторов, соединительных капилляров с внутренним диаметром 0,05-0,15 мм мини­мальной длины, колонок вместимостью 10-1000 мкл, детекторов с микрокюветами емко­стью 0,03-1 мкл и с высоким быстродействием, высокоскоростных самописцев и интегра­торов.