Принципы составления сред для культивирования микроорганизмов.

Для культивирования микроорганизмов применяют питательные среды, которые должны содержать все вещества, необходимые для их роста. Предложены сотни различных сред для культивирования микроорганизмов, состав которых определяется потребностями микроорганизмов в соединениях, необходимых для биосинтеза и получения энергии. Конструктивные и энергетические процессы у микроорганизмов крайне разнообразны, поэтому столь же разнообразны их потребности в питательных веществах. Из этого следует, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует.

Основными компонентами любой питательной среды для культивирования микроорганизмов являются соединения углерода и азота. И именно эти соединения определяют специфичность подавляющего большинства питательных сред.

По потребности в углероде микроорганизмы принято делить на две большие группы - автотрофы и гетеротрофы.

Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода углекислоту воздуха или карбонатов, тогда как потребности в углероде гетеротрофных микроорганизмов не могут быть удовлетворены только углекислотой. Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолого-биохимических особенностей организма могут быть представлены различными органическими соединениями, например, кислотами, спиртами, углеводами, углеводородами.

Неодинаковы требования микроорганизмов и ко второму основному компоненту питательной среды - азоту. Для микроорганизмов, фиксирующих молекулярный азот, используют среды, не содержащие соединений азота. В состав всех других сред входят различные азотсодержащие соединения. В составе могут быть нитраты или соли аммония, одна или несколько аминокислот. Наконец, известны организмы, нуждающиеся в полном наборе аминокислот или белках.

Потребности разнообразных групп микроорганизмов в больших элементах удовлетворяются обычно за счет одних и тех же минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу. Кроме элементов, необходимых для конструктивных процессов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных микроорганизмов соединения углерода в большинстве случаев являются и энергетическим материалом. В средах для хемотрофных организмов эту роль выполняют минеральные соли.

По составу принято выделять естественные или натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.

Естественными называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения. К таким средам относятся овощные или фруктовые соки, животные ткани, молоко, отвары или экстракты, полученные из природных субстратов и т.д.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие среды содержат все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако эти среды имеют сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ микроорганизмов, так как них трудно учесть потребление ряда компонентов и образования продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей. К числу натуральных сред, широко применяемых в лабораторной практике, относятся мясо-пептонный бульон, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды, почвенный экстракт.

Синтетические среды- это среды, в которые входят лишь соединения определенного химического состава, взятые в точно указанных количествах. Синтетические среды широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии микроорганизмов. Для разработки состава синтетических сред, обеспечивающих рост микроорганизмов или усиленный биосинтез какого-либо продукта жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и потребности его в источниках питания. В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам натуральным средам неопределенного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу.

Наряду с натуральными и синтетическими средами выделяют так называемые полусинтетические среды. Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического состава - углеводы, соли аммония, фосфаты и т.д. Однако в их состав всегда включаются вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой автолизат, почвенный экстракт или гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

По назначению различают элективные и дифференциально-диагностические (индикаторные) среды.

Элективные среды предназначены для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Они обеспечивают преимущественное развитие определенной группы микроорганизмов, для которой характерна общность физиологических свойств.

Дифференциально-диагностические среды (индикаторные) дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления бактерий из группы кишечной палочки в естественных субстратах может служить агарированная среда Эндо (см. приложение). Бактерии из рода Escherichia на этой среде образуют розовые и малиновые колонии с металлическим блеском, а бактерии рода Salmonella - бесцветные.

При определенной видовой принадлежности бактерий используют pH- индикаторные среды, в состав которых входит один из индикаторов нейтральный красный (0,0005%), феноловый красный (0,005%) или бромтимоловый синий (0,0005%). Если развитие микроорганизмов сопровождается образованием кислоты или щелочи, цвет индикатора изменяется. Дифференциально-диагностические среды особенно широко применяются в санитарной и медицинской микробиологии для быстрой идентификации определенных групп микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие, сыпучие и плотные среды.

Жидкие среды широко применяют для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.

Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений, а также в коллекциях для сохранения культур микроорганизмов. К таким средам относятся, например, разваренное пшено, отруби и др.

Плотные среды используются для выделения чистых культур, в диагностических целях для описания колоний, для определения количества микроорганизмов, их антибиотической активности, для хранения культур в коллекции и в ряде других случаев. С целью уплотнения сред применяют агар или желатин. Плотной основой могут служить пластинки силикагеля, которые пропитывают питательной средой.

Агар используют для уплотнения сред особенно часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входит агароза и агаропектин. Кроме того, агар включает небольшое количество легко ассимилирующих веществ и различные соли. Агар получают из водорослей и выпускают в виде пластин, стебельков или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100⁰С и затвердевает при температуре 40⁰С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных в настоящее время микроорганизмов. При остывании агаризованных сред образуется конденсационная вода. Чем меньше концентрация агара, тем больше выделяется воды. Поэтому при выращивании микроорганизмов на поверхности агаризованных сред в чашках Петри с целью получения изолированных колоний чашки помещают в термостат крышками вниз. В противном случае на внутренней стороне крышки скапливается конденсат, который, стекая на поверхность среды, мешает получению изолированных колоний.

Чаще всего агар добавляют к средам в количестве 2-2,5%. Среду с агаром нагревают на кипящей водяной бане до полного его расплавления. Если предполагают выращивать микроорганизмы на скошенной агаризованной среде в пробирках, то каждую пробирку заполняют средой не более чем на 1/3. Чтобы среда не подсыхала, ее скашивают после стерилизации, перед посевом. Для этого пробирки с расплавленной на кипящей водяной бане средой устанавливают в наклонном положении и дают среде застыть. Скошенная агаризованная среда не должна доходить до ватной пробки на 4-6 см. Среду, предназначенную для культивирования бактерий в чашках Петри, разливают по 20-25 мл в пробирки большего объема или стерилизуют в колбах.

В последнем случае агар до стерилизации не расплавляют.

Желатин - это экстракт, получаемый из субстратов, богатых коллагеном - белком костей, хрящей, сухожилий, чешуи. Образуемый желатином гель плавится при температуре 25⁰С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорганизмов (30-37⁰С). Кроме того, желатин разжижается протеолитическими ферментами, которые многие микроорганизмов выделяют в среду. Эти свойства желатина ограничивают ее применение в качестве уплотняющего средства. Желатин используют главным образом в диагностических целях - для выявления протеолитической активности микроорганизмов, а также для получения гигантских и глубинных колоний дрожжей. Желатин добавляют к жидким средам в количестве 10-15%, оставляют ее набухать 10-15 мин и нагревают на водяной бане до полного растворения. Все среды с желатином стерилизуют при 0,05 МПа в течение 15 мин или дробно.

Кремнекислый гель (силикагель) - используют как твердую основу для синтетических сред строго определенного состава, поскольку он является веществом неорганической природы.