1 Способ. Трансдукция.

Вектор, молекула ДНК или РНК, состоящая из векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-реципиент и встроить ее в геном. В состав вектора входит маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Выделяют 2 группы маркерных генов: селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам; репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях легко тестируется. За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые встраивают в каждую векторную молекулу. Для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены контролировались прокариотическими регуляторными элементами.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды – наиболее часто используемая для клонирования плазмида pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E.coli;

- вирусы – есть вирусы, не ведущие к гибели клетки, но встраивающиеся в геном клетки-хозяина, и размножающиеся вместе с ней, либо вызывающие ее неконтролируемый рост (превращение в раковую);

- гибридные векторы – содержат ДНК фага и плазмиды: космиды и фазмиды.

2 Способ. Трансформация (прямое введение гена в клетку):

- трансфекция: ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция, которые поглощаются клеткой путем фагоцитоза;

- микроинъекции ДНК микропипетками и микроманипулятором;

- электропорация – импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран;

- «мини-клетки», получаемые блокированием донорных клеток в митозе колцемидом. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются микроядра («мини-клетки»), инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия;

- упаковка в лизосомы – защита экзогенного генетического материала от действия рестриктаз;

- метод биолистики – один из самых эффективных методов трансформации растений: на частички вольфрама напыляются ДНК-векторы. Частички помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии стало возможным заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно: интерферон, инсулин, соматостатин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др.

Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать механизмы регуляции экспрессии генов и модифицировать генетический аппарат клетки.

Генотерапия – лечения заболеваний с помощью генов. Существует два типа генотерапии:

- заместительная генотерапия: в клетку вводят неповрежденный ген;

- корректирующая генотерапия: дефектный ген заменяют нормальным в результате рекомбинации.

Генотерапию используют для коррекции нарушений при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшена (заболевание мальчиков, связанное с дефектом Х-хромосомы): нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, вкалывают в мышечные волокна, используя либо «голую» ДНК, либо аденовирусный вектор, и ребенок приобретает способность двигаться. Однако пока удалось получить только временный терапевтический эффект, и поэтому процедура введения гена должна повторяться неоднократно.

Муковисцидоз – наследственное заболевание легких, поражающее в Центральной Европе одного новорожденного из 2500. Для него установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление этого гена – пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Неповрежденную копию гена, включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами СПИДа. ВИЧ – ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса.

Получение трансгенных животных. Для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые передадут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. Микроинъекцию клонированных генов производят в оплодотворенную яйцеклетку, затем ее имплантируют в яйцевод приемной матери. Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение.

В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови. Создан трансгенный крупный рогатый скот, в молоке которого содержится человеческий альбумин: каждая корова производит до 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина в год.

Трансгенных животных получают для трансплантации органов. Лучшие доноры органов – свиньи, т.к. имеется анатомическое сходство органов и иммунологическийх свойств. Реакции отторжения органов при трансплантации имеют сложный механизм, и одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.