Методы индикации и идентификации вирусов

Для индикации вирусов в инфекционном материале могут быть использованы следующие методы и критерии:

1. Микроскопический: обнаружение вирусных включений в препаратах, окрашенных но Муромцеву, Морозову, Романовскому, Пигаревскому, Павловскому, обработанные флюорохромами.

2. Вирусологическое выделение вирусов в культурах клеток, в развивающихся куриных эмбрионах, на лабораторных животных (состояние, симптомы).

3. В культуре тканей: реакция гемаглютинации (РГА), реакция гемадсорбции (РГадс), цитопатогенное действие (ЦПД), цветная проба, метод бляшек.

Идентификация вирусов осуществляется с помощью серологических (иммунологических) методов:

• реакция торможения гемагглютинации (РТГА),

• реакция торможения гемадсорбции (РТГадс),

• реакция связывания комплемента (РСК),

• реакция нейтрализации цитопатогенного действия (РН),

• реакция иммунофлюоресценции прямая и непрямая (РИФ, РНИФ),

• реакция преципитации в геле (РП),

• реакция нейтрализации цветной пробы.

Приложение 4

Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Берут 7-11 дневные куриные эмбрионы, проверяют их жизнеспособность на овоскопе, на нем же у эмбриона простым карандашом обводят воздушную камеру - главный ориентир для последующих манипуляций. Стерильным тампоном с йодом протирают верхнюю (тупую) часть яйца, затем 60° спиртом.

Заражение невскрытого эмбриона

А) В хорион аллантоисную полость: Делают по границе воздушной камеры яйца под углом 45° к его поверхности на глубине 0,3-0,5 см. После введения вирусного материала отверстие заливают расплавленным парафином, и эмбрион в специальных лотках помещают в термостат-инкубатор при t° +40; +42С° и влажности в 60 %.

Б) В амнион и куриный зародыш: Инфицируют толстой тупой иглой для спинномозговых пункций. Манипуляцию выполняют в темной комнате под контролем глаза, осторожно упираясь в эмбрион.

После заражения отверстие парафинируют, а инкубацию эмбриона продолжают.

Заражение вскрытого эмбриона:

Выполняют после снятия изогнутыми ножницами крышки яйца над его воздушной камерой, которую снимают очень осторожно.

А) Заражение в амниотический мешок выполняют после его подтягивания стерильным пинцетом.

Б) Заражение в желточный мешок проводят также.

В) обоих случаях дефект в скорлупе яйца закрывают: либо возвращением снятого тупого конца скорлупы, либо крышечкой от стеклянного бюкса. Их края для придания герметичности заливают парафином. Помещают в термостат-инкубатор.

Контрольные наблюдения ведут по критериям:

• подвижность эмбриона, как показатель жизнеспособности;

• появление на оболочках эмбриона бляшек с просяное зерно из внутриклеточных вирусных включений;

• общепринятая индикация и идентификация вируса (Приложение 3).

Приложение 5

РЕПРОДУКЦИЯ ВИРУСОВ С РАЗНЫМ ГЕНОМОМ

1.

Д НК- геномные цитоплазматические (вирус натуральной оспы)

А дсорбция на клетке- виропексис

Д епротеинизация, освобождение генома

С тратегия вирусного генома (СВГ)

Репродукция ДНК

В се этапы в цитоплазме клетки

Р епродукция ДНК (с участием эндорепликазы)

Т рансляция на рибосомы

Сборка вириона

В ыход из клетки

Синтез вирусного белка

Э ндогенная (вирусная) транскриптаза

Т ранскрипция

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки-хозяина

И-РНК

2.

Д НК -геномные ядерные (вирус герпеса)

А дсорбция на клетки -виропексис

Д епротеинизация. Освобождение генома

С ВГ

Р едупликация ДНК в ядре клетки хозяина

Р азобщенный (дизъюнктивный) синтез

Р епродукция ДНК в ядре клетки с участием экзорепликаз

Сборка вириона в цитоплазме

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки

Э кзогенная транскрипция (клеточная)

И -РНК транскрипция

Т рансляция на рибосомы

И так, синтез идёт по схеме: ДНК РНК белок

3.

Р НК-геномные минуснитевые (вирус гриппа)

А дсорбция на клетке- виропексис

Д епротеинизация. Освобождение генома

С ВГ

Р едупликация ДНК

И -РНК

Э кзогенная транскриптаза

транскрипция

М -РНК

М-РНК + репликативная форма

- Р «отштамовка» нитей с матрицы

Синтез вирусного белка на рибосоме

-РНК

-РНК

+ РНК

С борка вириона

+РНК выполняет функции И- РНК

Т рансляция на рибосомы

Синтез вирусного белка

И так, синтез идет по схеме РНК РНК белок

4.

Р НК геномные + нитевые

А дсорбция

Д епротеинизация

С ВГ

РНК

Функции И-РНК выполняет +РНК нить

Вирусный белок

+РНК

Экзотранскриптаза

+ РНК

Т рансляция на рибосомы

С интез вирусной репликазы (эндорепликазы)

+РНК

-РНК

М атрица для образования +нитей ДНК

Сборка вириона

Синтез вирусного белка

Репликативная форма

И так, синтез идет по схеме: РНК белок

5.

Д НК онкогенные вирусы

А дсорбция

д епротеинизация

И нтеграция в геном ДНК клетки хозяина

Р едупликация ДНК

Сборка вириона

И -РНК

Б елок вирусный

И так, синтез идет по схеме: ДНК РНК белок

6.

Р НК онкогенные вирусы (обратная транскрипция)

А дсорбция- виропексис

Д епротенизация

Р НК (одна нить)

В вирионе формируется РНК зависимая ДНК полимераза

С интез двунитчатой ДНК (провирус)

С ВГ

Р едупликация ДНК

С борка вириона созревание на мембранах клетки

Т рансляция ДНК (провируса при участии РНК- полимеразы клетки)

Синтез вирусного белка на рибосомах клетки