IX.4.2.4.Принципы установления первичной структуры белков
Расшифровка первичных структур важнейших биополимеров – белков и нуклеиновых кислот – имеет решающее значение для понимания их биологических функций. К настоящему времени достигнуты существенные успехи в разрешении этих проблем.
«Идеальная» схема расшифровки первичной структуры полипептидной цепи – ее специфический гидролиз с последовательным отщеплением от одного из концов по одному звену; к настоящему времени такие способы для длинных полипептидных цепей не разработаны. Применяемая сейчас стратегия (в упрощенном виде) сводится к следующему: А. Определяют N- и С-концевые звенья полипептидной цепи. Б. Полипептидную цепь расщепляют на небольшие фрагменты; для этого используют специфический гидролиз эндопептидазами (трипсином, химотрипсином и некоторыми другими) или специфическое химическое расщепление (например, бромцианом). Полученные фрагменты разделяют. В. Определяют первичную структуру каждого фрагмента; для этого проводят последовательное отщепление звеньев с одного конца – для фрагментов с относительно короткими полипептидными цепями такие методы разработаны. Г. На основании первичной структуры фрагментов делают вывод о первичной структуре исходного белка; для того, чтобы это стало возможным, необходимо иметь минимум два набора разных фрагментов исходной макромолекулы; вывод о последовательности фрагментов в макромолекуле делают, исходя из строения перекрывающихся участков фрагментов из разных наборов.
Определение N-концевых звеньев. А. Для определения N-концевых звеньев исходных полипептидных цепей наиболее широко используют метод Грея-Хартли:
П
олипептид
или белок реагируют с соединением (729),
сокращенно называемым дансилхлоридом,
которое взаимодействует с N-концевой
первичной аминогруппой с образованием
дансильного производного пептида (730).
Это производное подвергают кислотному
гидролизу; при этом все пептидные связи
расщепляются, а сульфамидная связь
SO2-NH
сохраняется; в результате все звенья,
кроме N-концевого,
превращаются в аминокислоты, а N-концевое
– в дансильное производное аминокислоты
(731). Это производное легко отделяется
от аминокислот и идентифицируется; оно
интенсивно флуоресцирует и может
обнаруживаться в очень малых количествах.
Б.
Для последовательного
отщепления
аминокислотных звеньев с N-конца
пептидной цепи используют метод Эдмана:
Пептид (часто это фрагмент исходного белка) реагирует с фенилизотиоцианатом с образованием соединения (732) – производного тиомочевины по N-концевому звену пептида. При действии кислоты в безводной среде от соединения (732) отщепляется N-концевое звено в виде производного N-фенилтиогидантоина (733); это производное отделяют и идентифицируют. Остальные пептидные связи при этом не затрагиваются, поэтому после отделения соединения (733) остается пептид (734), укороченный на одно звено по сравнению с исходным. Операцию отщепления концевого звена повторяют с пептидом (734) и т.д.
Деградация по Эдману – основной способ расшифровки первичных структур фрагментов, полученных специфическим гидролизом белков. Метод Эдмана удалось автоматизировать; определение первичной структуры в автоматическом режиме проводят в специальном приборе – секвенаторе Эдмана; для успешной расшифровки первичной структуры иногда достаточно1-2 мг пептида.
Определение С-концевых звеньев менее разработано, чем определение N-концевых звеньев. Химические методы оказались малоудовлетворительными; лучшие результаты дает использование карбоксипептидаз.
Выше были коротко рассмотрены некоторые аспекты расшифровки первичной структуры белков путем их химических превращений. В последнее время все большее значение приобретает установление первичной структуры белков по первичной структуре ДНК, кодирующих эти белки. В последние десятилетия достигнуты впечатляющие успехи в расшифровке первичных структур ДНК; удается определить первичные структуры полинуклеотидных цепей большой длины. Зная первичную структуру кодирующей ДНК гена и используя белковый код, легко определить первичную структуру белка, кодируемого этим геном. Как данный метод, так и традиционный химический, не гарантированы от трудностей и ошибок; поэтому при определении первичной структуры белков целесообразно сочетать оба этих подхода.
Резюме
Некоторые типы карбоновых кислот и их производных – хорошие мономеры для синтеза высокомолекулярных соединений. Поликонденсация дикарбоновых кислот, их ангидридов и хлорангидридов с диолами и диаминами позволяет получать полиэфиры и полиамиды, широко используемые в практике, в частности, для производства волокон. Мономеры с большей функциональностью позволяют получать пространственные полимеры, а также термостойкие полимеры – полиимиды.
Важнейшими природными полимерами являются белки, которые чисто химически являются разновидностью полиамидов. Основное отличие белков от синтетических полимеров – их монодисперсность, а также то, что они представляют собой сополимеры с первичной структурой. Необходимость воссоздания первичной структуры делает синтез белков намного более сложной задачей, нежели синтез обычных полиамидов; стратегия синтеза белков включает ряд специфических методов, связанных с защитой и активацией функциональных групп. Для расшифровки первичной структуры белков используют различные варианты специфического расщепления пептидных связей; используются химические и ферментативные методы. В последнее время первичные структуры белков устанавливают, исходя из первичной структуры кодирующих их ДНК.
Важнейшие биологические функции белков определяются их конформационной стабильностью – существованием в виде единственной (нативной) конформации. Конформации белков включают два уровня: вторичные и третичные структуры. При изменении условий нативные структуры разрушаются (денатурация).