Передумови виникнення технології рекомбінантних днк

В 1973 р. Стенлі Коен та Гілберт Бойер з співробітниками розробили спосіб переносу генетичної інформації від одного організму в інший. Цей метод одержав назву технології рекомбінантних ДНК і дозволив вченим виділяти конкретні гени і вводити їх в організм нового господаря. Три відкриття зробили можливим розвиток технології рекомбінантних ДНК.

В 1953 р. Джеймс Уотсон та Френсіс Крик відкрили знаменитий подвійний ланцюг ДНК і висунули основні постулати матричного синтезу.

Згідно з цим механізмом подвійний ланцюг ДНК під час реплікації розділяеться і кожний ланцюг служить матрицею для синтезу дочірнього ланцюга, котра за своєю первинною структурою є дзеркальним відображенням матриці. В результаті такого матричного синтезу утворюються дві ідентичні дволанцюгові молекули ДНК, кожна з яких передається в дочірні клітини. За таким самим механізмом здійснюється синтез РНК, але РНК синтезується у вигляді одноланцюгової спіралі, яка комплементарна матриці ДНК. Цей процес одержав назву транскрипції. А процес синтезу білку з матриці РНК (мРНК) відбувається на рибосомах, і структура білку відповідає структурі мРНК. Цей складний процес, що має назву трансляції, відбувається за допомогою транспортої РНК (тРНК). Вона транспортує амінокислоти і адаптує мову мРНК до мови білку. Таким чином, процес матричного синтезу ДНК визначає передачу спадкової інформації від материнської клітини в дочірню. В процесі матричного синтезу РНК відбувається передача інформації (генетичного коду даного білку) від ДНК на мРНК, а мРНК переносить інформацію на рибосому, де вона реалізується у вигляді конкретної структури білку.

При статевому процесі відбувається обмін ділянками між двома хромосомами від індивідуумів, що схрещуються. Цей процес отримав назву рекомбінації, і в клітині найчастіше відбувається тільки між гомологічними хромосомами, оскільки комплементарні за своєю структурою молекули ДНК притягуються і можуть обмінюватися генетичними складовими. Бувають і випадки негомологічної рекомбінації, якщо в одній з взаємодіючих молекул ДНК є гени, котрі кодують спеціальні ферменти розрізання ДНК.

Другим важливим відкриттям, зумовившим виникнення генної інженерії, стало знаходження в бактеріальних клітинах позахромосомних маленьких кільцевих молекул ДНК. Ці мініхромосоми одержали назву плазмід. Плазміди здатні до автономної реплікації, тому існують в клітині в декількох копіях. Дуже важливо, що завдяки своїм маленьким розмірам плазміди можуть бути виділені з клітини в неушкодженому, наітивному стані.

І нарешті, в 1970р. Келлі та Сміт із співробітниками зробили відкриття, що стало останньою необхідною передумовою для існування технології рекомбінантних ДНК. Вони виділили першу рестриктазу – фермент, який викликає гідроліз ДНК в строго визначених місцях з утворенням ”липких кінців” (див. гл. рестриктази)

Генетичний код. Організація генів

Генетичний код зв’язує послідовність основ даного гена або його РНК-транскрипта з амінокислотною послідовністю відповідного білка.

Код триплетний, це означає, що одна амінокислота задається послідовністю з трьох нуклеотидів, які називаються кодоном, або триплетом. В генетичному коді відсутні знаки, що відділяють один кодон від іншого.

Код не перекривається

Напрям зчитування закодованого запису – від 5′ кінця до 3′ кінця м-РНК, яка є транскриптом “+” ланцюга ДНК, зчитаним в напрямку 5′ → 3′. Перший з 5′-кінця кодон відповідає N-кінцевій амінокислоті поліпептидного ланцюга. Таким чином, білки синтезуються від N-кінця до С-кінця.

Таблиця коду показує, яка амінокислота кодується тим чи іншим кодоном (табл. 1.). В таблиці представлені 64 кодони, з яких 61 кодон детермінує ту чи іншу кислоту (наприклад, CUA відповідає лейцину Leu), а решта є сигналами термінації (UAA,UAG,UGA).

Стартовим сигналом для початку синтезу білка служить розташований на м-РНК кодон AUG, що кодує метионін (в деяких випадках це кодон GUG, який кодує валін). Існує два типи молекул т-РНК, що впізнають кодон AUG: один у випадку, коли кодон ініціюючий, другий – коли він кодує Met, який повинен бути приєднаний в середину поліпептидного ланцюга.

Код є вироджений, це означає, що більшість амінокислот кодується більш ніж одним кодоном. Наприклад, Phe кодується двома кодонами: UUU та UUC. Кодони, які визначають одну амінокислоту називаються кодонами – синонімами. При рішенні задач зазвичай вибирають перший з кодонів – синонімів.

Рамка зчитування задає положення першої основи кодона м-РНК. Оскільки код триплетний, то кількість можливих рамок зчитування дорівнює трьом. В більшості випадків функціональний білок синтезується тільки по одній рамці зчитування, але деякі віруси використовують дві, або навіть три рамки зчитування. У вірусів гени перекриваються, тобто одна і та сама послідовність нуклеотидів кодує два або три різних білка. Таке використання ДНК дає значну економію генетичного матеріалу. Треба пам’ятати , що віруси використовують в якості генетичного матеріалу як ДНК, так і РНК.

РНК як правило складається з одного ланцюга. ДНК може бути як дволанцюговою (бактеріофаги Т2,Т4,Т5,Т6...), так і одноланцюговою (бактеріофаг ФХ174).

Мутація – це зміна послідовності основ генетичного матеріалу організму. Знання генетичного коду дозволяє пояснити ефект деяких мутацій. В багатьох випадках зміни в нуклеотидній послідовності приводять до утворення синонімічного кодону, в наслідок такої зкритої мутації амінокислотна послідовність білка не змінюється.

Місенс–мутація (заміна) веде до заміщення однієї амінокислоти на іншу, в результаті такої заміни послідовності основ, яке не призводить до утворення синонімічного коду.

Мутація із зсувом рамки зчитування відбувається в результаті вставки або видалення (делеції), одного чи більшого числа нуклеотидів.

Структурний ген – це найменша ділянка ДНК або РНК, що кодує повну амінокислотну послідовність будь-якого білка. В клітинах тварин може міститися до 100 000 генів, у вірусів лише 3 – 100 генів.

Структурні гени еукаріот містять ділянки екзони – кодуючі ділянки та інтрони - ділянки, що не несуть інформації. Наприклад, ген яєчного альбуміна курки містить 8 інтронів, загальна довжина яких перевищує суму всіх кодуючих послідовностей. Такі гени називаються переривчастими.

В процесі транскрипції РНК–полімераза знімає копію з усього гену. Після цього відбувається сплайсинг – видалення інтронів, та з’єднання екзонів. Місцем впізнавання для сплайсинг-ферментів служить спеціальна нуклеотидна послідовність в інтроні:

5′ – GA CGC AG – 3′

3′ – CT GCG TC – 5′

Місце сплайсингу визначається з високою точністю, оскільки помилка навіть в одну основу приведе до синтезу білка з неправильною амінокислотною послідовністю.

Після сплайсингу первісний РНК–транскрипт модифікується в залежності від типу РНК. В еукаріот до 5′ кінця м-РНК приєднується спеціальна структура, що називається cap-структурою (шапочка). Модифікація 3′ кінця полягає в тому, що до нього приєднується послідовність poly(А) довжиною ~ 150 нуклеотидів.

Процес утворення зрілої м-РНК називається процесингом.

Всі живі організми – еукаріоти, прокаріоти і віруси використовують один і той самий (з невеликим виключенням) генетичний код, таким чином він є універсальним.

Таблиця 1