3. Приготовление агарозного геля (демонстрация) и проведение горизонтального электрофореза выданных образцов днк.

Горизонтальный электрофорез образца Fermentas Gene Ruler^TM DNA Ladder Mix SM0331 известного состава (фото 1, колонка слева), электрофорез 10 неизвестных образцов (нумерация слева направо, фото слева)

С равниваем расстояния, пройденные молекулами ДНК при горизонтальном электрофорезе, с расстояниями, пройденными компонентами Fermentas Gene Ruler^TM DNA Ladder Mix SM0331 известной массы, получаем приблизительную информацию о размере молекул ДНК (в парах нуклеотидов, bp)

№	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
bp	3000	3000	3000	3750	3750	1500	2750	2500	3500	3000

Далее хотим определить концентрацию молекул ДНК, она определяется по яркости полосы. Мы не можем оценить концентрацию образцов 1-8, 10, т к яркость их полос значительно превышает яркость маркера. В 9 же образце яркость примерно совпадает с маркером, значит, примерно совпадает и концентрация, весовая равна 27,5 нг/0, 5мкг, или 55 нг/мкг (использованы данные по маркеру). 0,5 мг/мкл – плотность раствора маркера (данные из интернета), значит, смешанная концентрация ДНК в 9 образце 27,5 нг/мкл.

Масса 1 молекулы ДНК 9 образца:

кол-во пар нуклеотидов*массу одного нуклеотида*2 (ДНК E. Coli двухцепочечная)

bp*600 а е м=3500*600=2 100 000 а е м (bp – base pairs – пары нуклеотидов)

а е м переводим в нанограммы:

2 100 000*1,66*10^(-15)=34,86*10^(-10) нг – масса 1 молекулы ДНК 9 образца

Молярная концентрация:

(Ссмеш/m молекулярн.)/N Авогадро

27,5(нг/мкл)/34,86*10^(-10) нг=78,89*10^8 молекул в мкл

78,89*10^8(молекул/мкл)/6,022*10^23(молекул/моль)=13,1*10^(-3) микромоль на литр

4. Приготовление акриламидного геля (демонстрация) и проведение электрофореза выданных образцов белка.

Белковый маркёр молекулярных масс SM0661 Fermentas

Нумерация образцов на фото от 0 до 9, 0 – маркер, 1 и 9 – собственные белки E. Coli без индукции.

В вертикальном электрофорезе мы использовали белковый маркёр молекулярных масс SM0661 Fermentas (крайняя левая полоса на снимке) и 9 белковых образцов.

1 и 9 образец одинаковы, это собственные белки E.Coli. С образцами 2-8 работаем методом исключения, обращая внимание только на те белки, которые отсутствуют в 1 и 9 образцах (или же их концентрация сильно повышена по сравнению с 1 и 9).

Процедура анализа данных аналогична проделанной нами в горизонтальном электрофорезе ДНК: по известным данным маркера находим массу интересующих нас белков (в килоДальтонах).

№	2	3	4	5	6	7	8
kDa	55	40	45, 20	55	55	55	55

Видим, что в 4 образце у нас не только появился новый белок, но и содержание уже имевшегося белка массой 20 кДа повысилось. Скорее это является побочным эффектом индукции и эти белки являются просто продуктами распада.

В образце 3 новых белков не выявлено, но экспрессия одного из собственных белков E.Coli резко возросла, что наверняка связано с индукцией образцов ДНК.

Теперь займемся подсчетом длины кодирующего гена. Первичная структура белка представляет собой последовательность аминокислот, массу одной аминокислоты примем за 100 Да. Разделив массу белка на массу одной аминокислоты, получим количество аминокислот в белке. Зная, что одна аминокислота кодируется триплетом (3 нуклеотидов), определим количество пар нуклеотидов, кодирующих белок. В бактериальной ДНК нет некодирующих участков, молекула ДНК E.Coli двухцепочечная.

m молекулы белка/m аминокислоты=количество аминокислот в молекуле белка (2 строка таблицы)

кол-во аминокислот в молекуле белка*3=количество пар нуклеотидов в кодирующей молекуле ДНК (3 строка таблицы)

Мы знаем размер молекул ДНК в образцах, использовавшихся в горизонтальном электрофорезе, знаем размер молекул ДНК, кодирующих белки в образцах вертикального электрофореза. Можем попробовать примерно соотнести одно с другим и предположить, какой из образцов ДНК ответственен за появление того или иного белка в E.Coli.

Еще раз взглянем на размеры образцов ДНК в горизонтальном электрофорезе:

№	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
bp	3000	3000	3000	3750	3750	1500	2750	2500	3500	3000

И на размеры молекул ДНК, кодирующих образцы белков:

№	2	3	4	5	6	7	8
bp	1650	1200	1350	1650	1650	1650	1650

6 образец ДНК из горизонтального электрофореза длиной примерно 1500 bp мог вызвать экспрессию белка в 3 или 4 образцах. Другие образцы ДНК вряд ли можно отнести к каким-либо белкам, так как разница в результатах слишком велика (а у бактерий нет некодирующих участков). Белки массой 20 кДа, вероятнее всего являются побочными продуктами индукции синтеза белков (продукты распада).

15