Реакция агглютинации (ра)
При диагностике инфекционных заболеваний реакцию агглютинации проводят в двух направлениях:
определяют вид выделенного от больного микроба-возбудителя с помощью диагностической агглютинирующей сыворотки, содержащей специфические антитела;
обнаруживают антитела в сыворотке больного животного, используя стандартный микробный диагностикум, включающий антигены. Титром агглютинирующей сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.
при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и других инфекционных болезнях,
Реакция основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:
1) специфическая фаза - связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом - активным центром иммуноглобулина (невидимая фаза);
2) неспецифическая (видимая) фаза - образующийся комплекс (АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например в 0,85% растворе натрия хлорида.
Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевый осадок, безжгутиковые и бескапсулярные - мелкозернистый, капсульные - тяжистый. Существуют два способа постановки реакции агглютинации: пластинчатый и пробирочный. Пластинчатый метод является качественной реакцией и служит для предварительного определения вида микроба. Пробирочный метод используется для определения количественного содержания антител, при этом в пробирках ставится развернутая реакция агглютинации
Развернутая ра для выявления антител в исследуемой сыворотке крови
Для постановки реакции необходимо иметь:
1) исследуемую сыворотку крови;
2) 0,85% раствор NaCI (физиологический раствор);
3) антигенный диагностикум, т.е. взвесь микроба определенной концентрации.
Вначале готовят разведение сыворотки больного. В отдельную пробирку добавляют 2,4 мл физиологического раствора и 0,1 мл сыворотки - получается разведение сыворотки 1:25, это основа для последующего приготовления ряда последовательных двукратных разведений. В штатив устанавливают 7 пробирок, 2 последние из них - контрольные. Во все пробирки, кроме последней (контроль сыворотки), наливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем из пробирки (основное разведение сыворотки 1:25) берут 0,5 мл и добавляют в первую пробирку - здесь получилось разведение 1:50. Из 1-й пробирки вновь берут 0,5 мл и переносят во 2-го - здесь разведение сыворотки составляет уже 1:100. Таким же образом готовят ряд последовательных двукратных разведении сыворотки. Из 5-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают в сосуд с дезинфицирующим раствором. В 6-й пробирке - только физиологический раствор (контроль антигена), в 7-ю добавляют 0,5 мл основного разведения сыворотки (1:25).
На следующем этапе работы во все пробирки, кроме 7-й (контроль сыворотки), вносят по 2-3 капли антигенного диагностикума, т.е. живой микробной взвеси, содержащей 3-4 млрд. микробных тел в 1 мл. Жидкость во всех пробирках мутнеет. Штатив с пробирками встряхивают и помещают на 2 ч в термостат. Через 2 ч учитывают предварительный результат реакции (агглютинация с Н-антигеном).
Окончательный результат учитывают через 16-18 ч при нахождении пробирок в условиях комнатной температуры (агглютинация с О-антигеном). При положительной реакции на дне пробирки образуется агглютинат - осадок в виде перевернутого зонтика, надосадочная жидкость остается прозрачной (рис.6). При встряхивании пробирки наблюдаются так называемые "смерчи", которые быстро распадаются на крупные хлопья. Отрицательная реакция - содержимое пробирки равномерно мутное, отсутствует осадок. Жидкость такая же, как и в 6-й пробирке (контроль антигена). В 7-й пробирке (контроль сыворотки) жидкость прозрачна, но нет осадка (табл.7).
Учет реакции агглютинации на стекле производится через 5 - 10 мин, пробирочной - через 18 - 20 часов.
За титр сыворотки принимают последнее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается четкая агглютинация. Интенсивность РА оценивают по 4-х крестовой системе. Положительной считается как минимум 3-х крестовая реакция.
