Глава 2 Методы изучения биоплёнок. 26

2.1Методы культивирования биоплёнок. 26

2.2.Генетические методы изучения биоплёнок. 31

2.3.Методы выявления биоплёнок. 35

Заключение. 40

Список литературы: 41

Приложения. 42

Введение.

Вплоть до конца прошлого века микробиология развивалась главным образом на основе исследований чистых культур микроорганизмов. Этот традиционный путь, сложившийся на общепринятых представлениях о том, что в природных условиях бактерии существуют как свободно плавающие

(планктонные) клетки, позволил получить сведения об основных жизненно важных процессах, происходящих в микробных клетках. Другими словами, все знания о морфологии, физиологии, генетике, адаптационных возможностях бактерий были получены при изучении планктонных форм бактерий. В настоящее время известно, что более 99% бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток, а в виде прикрепленных к субстрату биопленок (Biofilms).

Образование биопленкок и их функционирование – пример сложного социального поведения бактерий, регулируемого и управляемого не только сигналами из окружающей среды, но и межклеточными связями.

В настоящее время считается общепринятым представление о том, что развитие биопленочных сообществ – одна из основных стратегий выживания микроорганизмов не только в окружающей среде, но и в организме человека и животных. Поэтому одной из главных проблем является лечение инфекций, ассоциированных с биопленками, и она представляет значительные трудности. Связано это с тем, что в составе биопленок бактерии приобретают качественно новые свойства по сравнению с микроорганизмами в планктонной форме. Это касается, в первую очередь, способности биопленочных бактерий защищаться от стрессовых воздействий, включая устойчивость к антибиотикам, дезинфектантам и эффекторам (гуморальным и клеточным) иммунной системы человека.

Прогресс в изучении феномена биопленок связан в основном с совершенствованием техники микроскопирования и, в первую очередь, с применением конфокального сканирующего лазерного микроскопа и атомно-силового микроскопа. Однако стоит отметить тот факт, что механизмы образования биопленок до настоящего времени во многом не ясны.

Дальнейшее изучение механизмов формирования биопленки и ее функций открывает новые возможности для лечения и профилактики целого ряда заболеваний.

Глава 1 Общее представление о биоплёнках.

1.1.Механизмы и этапы формирования биоплёнок.

Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов. Это определение позволяет отличить микробные сообщества биопленок от похожих на них лишь внешне структур, например, колонии бактерий, растущих на поверхности агара, которые не проявляют ни одной из характеристик, свойственных истинной биопленке.(1)

Для того, чтобы доказать присутствие именно биопленки, а не других бактериальных структур, используют разнообразные методические подходы, направленные на обнаружение:

1) элементов биопленочного внеклеточного матрикса;

2) генов, контролирующих биопленкообразование;

3) сложных архитектурных структур, специфичных для биопленки. (8)

Образование биопленок – это сложный комплексный динамический процесс, состоящий из нескольких этапов.

Выделяют пять стадий развития биопленки:

1. Сначала происходит первичное прикрепление микроорганизмов к поверхности (адгезия, сорбция) из окружающей среды (обычно жидкости). Эта стадия обратима.

2. Окончательное (необратимое) прикрепление, иначе называемое фиксацией. На этой стадии микробы выделяют внеклеточные полимеры, обеспечивающие прочную адгезию.

3. Созревание (в англоязычной литературе — созревание-I). Клетки, прикрепившиеся к поверхности, облегчают прикрепление последующих клеток, внеклеточный матрикс удерживает вместе всю колонию. Накапливаются питательные вещества, клетки начинают делиться.

4. Рост (в англоязычной литературе — созревание-II). Образована зрелая биопленка, и теперь она изменяет свой размер и форму. Внеклеточный матрикс служит защитой клеток от внешних угроз.

5. Дисперсия (выброс бактерий): в результате деления периодически от биопленки отрываются отдельные клетки, способные через некоторое время прикрепиться к поверхности и образовать новую колонию.(5)

Изначальное прикрепление микробной клетки к поверхности субстрата осуществляется за счет действия электростатических, гидрофобных сил, сил Ван дер Ваальса, неспецифической адгезии. По результатам опытов in vitro установлено, что степень адгезии с последующим формированием биопленок наиболее выражена к таким материалам, как латекс, силикон, поливинилхлорид. Адгезия к тефлону, полиуретану, нержавеющей стали и титану проявляется в меньшей степени. Все вышеперечисленные материалы широко применяются в медицинской практике, что является дополнительным риском появления биопленок.

Адгезия к биологическим поверхностям (к клеткам тканей, стенкам сосудов) обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартмента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток.

Рассмотрим некоторые примеры механизмов прикрепления у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Важнейшим элементом в процессе адгезии стафилококков является (Polysaccharide Intercellular

Adhesin) (PIA) – полисахарид, который участвует как в клеточной субстратной адгезии, так и в последующем формировании клеточных кластеров (клеточно-клеточная адгезия). PIA инициирует гемагглютинацию и препятствует фагоцитозу за счет активации бактериальной агрегации. Еще один изученный компонент экзоплазматического компартмента это α-токсин стафилококков, кодируемый геном hla. Этот токсин, помимо основной своей функции – образования поровых каналов в мембранах клеток эукариот (один из факторов вирулентности), – обладает еще и свойствами адгезина. Мутанты с нарушенным биогенезом α-токсина и / или PIA не способны формировать полноценные биопленки. Также на первых стадиях формирования биопленок стафилококков значительную роль играют BAP-белки (biofilm associated protein), тейхоевые кислоты, n-ацетилглюкозамин. За процессы адгезии, синтеза PIA и прочих структурных компонентов матрикса биопленок отвечает ica-оперон, находящийся в сложной системе генетической регуляции, охватывающей также экспрессию факторов вирулентности. icaADBC-локус обнаружен у многих видов стафилококков, а также среди некоторых других грамположительных микроорганизмов. Все вышеуказанные синтезируемые компоненты специфически взаимодействуют с субстратами, они осуществляют якорную функцию и инициируют дальнейшие процессы образования биопленки.

У грамотрицательных микроорганизмов важную роль в адгезии и клеточной агрегации играют жгутики и фимбрии IV типа. Движение, обусловленное жгутиками, способствует распространению и образованию клеточного монослоя на субстрате, а фимбрии IV типа участвуют в клеточной агрегации за счет лектинового взаимодействия. Обнаружено, что в начальные фазы образования биопленок, у P.aeruginosa, активируются crc-гены, ответственные за биосинтез фимбрий. Также экспрессируется ген pilA, кодирующий белок пилин, являющийся структурной единицей фимбрий. В опытах с P.aeruginosa было показано, что мутантные штаммы по генам, участвующим в биогенезе жгутиков и фимбрий IV типа, не способны в полной мере формировать биопленки. (3)