2.7. Деякі методичні проблеми

Валідація (легалізація) методів аналізу рослин є одним з критичних етапів, що забезпечує надій­ність результатів. В ідеальному випадку, кожен з методів повинен бути сертифікований для використання спочатку в обмеженому числі лабораторій з метою забезпечення відтворюваності та надій­ності результатів. Європейська комісія на початку схвалила метод імуносорбентного аналізу (ELISA) ті ПЛР метод для аналізу сирих матеріалів, що містять Roundup Rсady соєві боби, та ПЛР метод для Bt-176 кукурудзи, а також ПЛР метод для визначення як Roundup Rсady соєвих бобів, так і Bt-176 кукурудзи в продуктах харчування, що піддалися технологічним обробкам. У подальшому було легалі­зовано велике число методів для кількісного та якісного аналізу ГМ рослин та продуктів їх переробки.

Без сумніву, надзвичайно важливим для надійного аналізу є якість самої виділеної молекули ДНК. Сьогодні розроблено та широко використовуються різні модифікації методів виділення ДНК з рослин - виділення за допомогою катіонних СЧАО, за допомогою гуанідинтіоціанату, на іонообмінних смолах тощо. Крім цього, в продажі наявні набори для виділення ДНК від різних фірм-виробників. Напевно, для кожного з об'єктів аналізу потрібно підібрати та оптимізувати свій метод виділення ДНК. Якість виді­леної ДНК перевіряють спектрофотометрично або за допомогою електрофорезу [6].

Висновки

Метод оцінки фенотипу є недорогим та досить чітким засобом іденти­фікації ГМ рослин у зразках насіння.

ELISA - більш швидкий та менш дорогий метод у порівнянні з ПЛР. Різновиди цього методу (ДНК-кити та індикаторні смужки) дають напівкількісні результати присутності ГМО в зразках, проте мають невисокий поріг детекції. Недоліком імуносорбентного аналізу є певні труднощі кількісних розрахунків, тому що ступінь експресії впроваджених білків у ГМО змінюється залежно від типу тканин, що може впливати на визначення частки ГМ матеріалу в зразках. Метод індикаторних смужок - більш швидкий, проте дає напівкількісні результати, що не можуть гарантувати точну відсут­ність ГМО в матеріалі зразка. Водночас компанії, які займаються виробництвом індикаторних смужок, надають інформацію, що залежно від мети, за допомогою цієї методики можна детектувати ГМО на рівні 0,01 %.

Слід відзначити, що ELISA та індикаторні смужки створені для аналізу специфічних генно-інженерних конструкцій, тоді як деякі білки-мішені можуть бути присутніми в багатьох ГМ рослинах (наприклад, сорти кукурудзи Bt-176, Bt-2 та Моn 810 містять один й той же Cry І білок).

Найбільш коректну ідентифікацію ГМО та найвищий рівень надійності забезпечують сьогодні методи, засновані на проведенні полімеразної ланцюгової реакції. Чутливість ПЛР, як, власне, й інших методів аналізу ДНК, значною мірою визначається чистотою та якістю самої молекули ДНК. Якість виділеної молекули ДНК, у свою чергу, визначається її розмірами та ступенем деградації і залежить від використаних реагентів, методу виділення та ступеня обробки матеріалу (якщо йдеться про зразки, що зазнали певних технологічних обробок). Наявність тих чи інших домішок у препа­ратах виділеної ДНК може впливати на активність і тим самим визначати межу чутливості методу ПЛР. Крім того, чутливість методу полімеразної ланцюгової реакції визначається якістю праймерів, концентрацією іонів магнію та температурним режимом реакції. Однак, принциповим для обговорення питання про межу чутливості методу ПЛР є мінімальна кількість копій трансгенів на геном, яку можна детектувати цим методом.

Експериментально встановлено, що межа виявлення в ПЛР-експериментах становить 0,005% ГМО/неГМО, що відповідає 30 копіям толерантного до гербіциду (RR) гаплоїдного геному сої, або 9 копіям стійкого до шкідників (Bt) гаплоїдного геному кукурудзи. Ці цифри встановлено поетапним розведенням матричної молекули ДНК та проведенням ПЛР і визначенням того ступеня розведення ДНК, коли ще детектуються ПЛР-продукти.