3.Методы лабораторной диагностики протеоза животных

Протеусы широко распространены в природе, выделяются из почвы, сточных вод, навоза, обитают часто в организме животных и человека. Бактерии относятся к условно-патогенным микроорганизмам. Они способны (чаще у животных P.vulgaris) вызывать пищевые и кормовые токсикоинфекции у человека и животных. Кроме того, бактерии вызывают нагноение ран, энтериты, перитониты и сепсис. Проникая через яичную скорлупу, вызывают замирание зародышей птиц. Протеусы проявляют патогенные свойства при ослаблении естественной резистентности, особенно среди молодняка сельскохозяйственных животных. Постоянно выделяются культуры в ассоциации с патогенными эшерихиями при колибактериозе.

Протеоз – остро протекающая инфекционная болезнь молодняка всех видов животных, с признаками септицемии или профузного поноса, тяжелой интоксикацией и обезвоживанием организма, болезнь может сопровождаться менингитом и поражением мочевыводящих путей.

Систематика см. лекцию.

Этиология болезни. Бактерии всех видов этого рода – мелкие грам “-” палочки длиной 1,0-3,0 мкм, шириной – 0,4-0,6 мкм. Однако протеям в большей мере присущи проявления полиморфизма, обнаружение при микроскопии мазков кокковидных и направильных очертаний инволюционных форм, возможно образование сферопластов. Протеи не образуют капсул и спор, как правило, подвижны (перитрихи), причем более выраженная подвижность имеет место при температуре 20-22⁰С, им не свойственно образование пигмента. Протеи факультативноанаэробные микроорганизмы. Они способны расти на простых по составу питательных средах в широком диапозоне температур (от 10 до 43⁰С) причем их рост сопровождается неприятным гнилостным запахом.

На МПА – характерный сливающийся рост без образования отдельных колоний (феномен роения) – образование вуалеобразного налета. Данный феномен характерен для P.vulgaris и P.mirabilis. Другие виды не проявляют спонтанной способности к роению, но это свойство может быть у них индуцировано посевом на пластинчатые среды с пониженными концентрациями агара и культивированием при 20-25⁰С.

При наличии в составе питательных сред солей желчных кислот (среда Плоскирева, висмут-сульфит агар, SS-агар, агар Мак-Конки и др.) происходит подавление роения (рост протея в О-форме).

На среде Плоскирева протеи образуют крупные (D 2-3 мм), полупрозрачные изолированные колонии правильных очертаний, слегка выпуклые с желтовато-розоватым (перламутровым) оттенком; среда в зоне роста колоний подщелачивается и приобретает желтизну. На висмут-сульфит агаре через 48 ч культивирования колонии протея имеют грязно-коричневый цвет, а после их снятия на среде остается темно-коричневая редукционная зона. В МПБ – интенсивное помутнение, наличие тонкой пленки на поверхности среды.

Для получения чистых культур протея используют посев по Шушкевичу (в конденсационную жидкость скошенного питательного агара) – рост по всей поверхности среды.

Наличие у протеев фенилаланиндезаминазы служит родовым дифференциально-диагностическим признаком. Протеи дают положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра, растут в присутствии КСN (калия цианида).

Патологоанатомические изменения: у погибших животных имеют картину катарального или катарально-геморрагического гастроэнтерита, нередко с множественными кровоизлияниями в слизистой желудка, под капсулой селезенки, почек; иногда отмечается очаговая катаральная пневмония и отек легких.

Лабораторная диагностика протеоза включает выделение культур с последующей их идентификацией по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам и определение их патогенности.

Для посмертной диагностики в лабораторию направляют от 2-4 свежих трупов или убитых с диагностической целью: сердце, перевязанное лигатурой вблизи разреза сосудов, долю печени с желчным пузырем, селезенку, почки, голову (головной мозг), трубчатую кость, брыжеечные лимфатические узлы, регионарные воспаленному участку кишечника, а также пораженный отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный с двух концов лигатурой (в отдельной посуде или полиэтиленовом пакете). Патологический материал исследуют в день его поступления.

Первый день. Патологический материал засевают в пробирки с МПБ, на скошенный МПА и на плотные дифференциально-диагностические среды среду Эндо или Левина, среду Плоскирева и (висмут-сульфитный агар),ss-агар, агар Мак Конки.

Чашки и пробирки с посевами на жидких и плотных питательных средах инкубируют при температуре 37-38⁰С в течение 24-48 часов и проводят осмотр на наличие и характера роста выросших культур.

Второй день. После инкубации в течение 18-24 часов при 37⁰С чашки с посевами просматривают и отмечают колонии, подлежащие дальнейшему использованию. Если рост 18-24 часовой культуры однородный, то для дальнейшего изучения используют не менее 3-х колоний. При росте разных колоний берут больше колоний, различных по внешнему виду.

На МПБ бактерии рода Proteus образуют поверхностную пленку в виде вуалеобразного налета с придонным ростом и неприятным запахом.

Характерной особенностью роста протея на МПА является роение и образование вуалеобразного налета в виде концентрических колец роста по периферии центральной колонии. Поверхность роящих культур покрывается тонким слоем налета с голубоватым оттенком (Н-формы колоний). При наличии в составе питательных средах солей желчных кислот (среда Плоскирева, висмут-сульфитный агар и др.) происходит подавление роения, и протей образует выпуклые, сероватые, бесцветные колонии (О-формы).

На среде Плоскирева протей формирует изолированные, крупные, правильных очертаний, слегка выпуклые, полупрозрачные колонии желтовато-розового (перламутрового) цвета. В зоне роста среда подщелачивается и желтеет. При более длительном хранении чашек с посевами колонии мутнеют, а центр их приобретает бурую окраску.

На висмут-сульфитном агаре через 48 часов культивирования образуются серо-коричневые колонии, а под ними формируется черно-коричневая редукционная зона.

На агаре Мак Конки и Эндо протей формирует бесцветные колонии.

Наличие характерного в виде тонкого муарообразного налета, поднимающегося вверх от конденсата на свежескошенном агаре, резкого гнилостного запаха, неспорообразующих грамотрицательных палочек в мазках указывает на присутствие бактерий рода Proteus.

Третий день. Микроскопия мазков из культур окрашенных по Граму Важнейшим признаком, отличающий протеев от других видов энтеробактерий, является способность дезаминировать фенилаланин. Для этого к одно-двухсуточной культуре на среде с фенилаланином (рецепт № 1) в наклонном положении добавляют 10-12 капель 10%-ного раствора хлористого железа (FeCl₃×H₂O). При положительной реакции через 2-3 минуты культура окрашивается в зелено-синий или зелено-голубой цвет. В случае отрицательной реакции цвет культуры не изменялся.

3.2 Общими свойствами представителей рода Proteus является способность к росту в присутствии KCN, положительная реакция с метиловым красным и отрицательная реакция Фогеса–Проскауэра.

3.2.1 Для постановки реакции с метилротом на пробирки с двухсуточной культурой бактерий в среде Кларка (рецепт № 2) отсасывают в чистую сухую пробирку 2,5 мл бактериальной культуры, добавляют к ней 8-10 капель индикатора метилрота, пробирку встряхивают, после чего учитывают реакцию. Изменение цвета культуры в розовое окрашивание (рН 5,0) означает положительную реакцию, желтое (рН выше 6.0) окрашивание свидетельствует об отрицательной реакции, при сомнительной реакции культуры окрашивается в светло-оранжевый цвет (рН 5,0-6,0).

3.2 Для постановки реакции Фогеса-Проскауэра к 2,5 мл культуры бактерий, выращенных на среде Кларка, добавляют в начале 1 мл 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола (рецепт № 3), а затем 0,4 мл 40%-ного водного раствора КОН, пробирку тщательно встряхивают и спустя 3-5 мин учитывают результаты. При наличии в культуре ацетилметилкарбинола она окрашивается в розовый цвет. Положительная реакция, окраска культуры в желтый цвет свидетельствует об отрицательной реакции, при сомнительной реакции культура окрашивается в светло-оранжевый цвет.

3.3 Для изучения биохимических свойств протея делают посев изучаемых культур на среды с углеводами. Протеи не ферментируют лактозу, арабинозу, дульцит, не обладают декарбоксилазой лизина, дегидролазой аргинина, не утилизируют малонат. Выраженная гетерогенность протеев проявляется в вариабельности их по отношению к манниту, сахарозе, адониту, глицерину, инозиту, мальтозе, салицилину, (рецепт № 4), инозиту, мальтозе, салицину, мочевине (рецепт № 6), сероводороду (рецепт № 7) утилизации цитрата в среде Симонса (приложение рецепт № 5). Эти свойства имеют ведущую роль для внутривидовой и внутриродовой дифференциации протеев. Для облегчения дифференциации различных видов протеев по биохимическим свойствам в таблице 1 приведено ряд основных тестов.

Таблица 1

Дифференциация видов рода Proteus

Тест или субстрат	Виды
	P. vulgaris	P. mirabilis	P. morgani	P. rettgeri	P. inconstans
Индол	+	-	+	+	+
Сероводород	+	+	-	-	-
Мочевина	+	+ (-)	+	+	-
Желатин (220С)	+	+	-	-	-
Орнитиндекар- боксилаза	-	+	+	-	-
Мальтоза	+	-	-	-	-

3.4 Важным дифференциальным признаком, отличающим протеев от бактерий родов Providencia и Morganella, является способность 85-100% изолятов рода Proteus давать феномен «роения» на плотных питательных сферах и вызывать покраснение скоса лизино-железного агара, что обусловлено дезаминированием лизина и образованием кетокислот, дающих оранжево-красное окрашивание в присутствии хлорида железа.

3.5 Дифференциальным признаком бактерий рода Providencia является:

3.5.1 Способность у 25-40% изолятов образовывать полиморфные структуры в виде деревьев, протуберанцев, но не классических концентрических кругов, свойственных для протея.

3.5.2 Образование от бесцветных до оливково-зеленых колоний при росте висмут-сульфитном агаре и желтых колоний на селективной среде с колистином (100 мкг/мл) и инозитом (1%).

3.5.3 Выделение провиденций на РАМ-агаре, предложено Сениором. Принцип выделения основан на отсутствии у провиденций, способности ферментировать ксилозу, галактозу и маннит. Выросшие колонии провиденций окрашиваются в красный цвет, прочие оксидазо-отрицательные бактерии образуют лимонно-желтые колонии.

3.6 Дифференциальным признаком, отличающий морганелл от протеев является отсутствие покраснения скоса лизино-железного агара, что обусловлено, отсутствием способности дезаминировать лизин и образовывать кетокислоты.

Характерная для рода Proteus реакция дезаминировать фенилаланин проявляется и у M. morgani, но она менее интенсивно выражена и дает слабое зеленое окрашивание.