Исследование воздуха

Имеется несколько методов микробиологического исследования возду­ха, но наиболее простым из них является седиментационный - осе­дание микробов по Коху. При использовании этого метода чашки Петри с питательной средой открывают на 5 мин, а иногда и на более продолжительное время (в зависимости от загрязнения) в том поме­щении, где необходимо определить чистоту воздуха. Чашки закрыва­ют и ставят в термостат при температуре 30—35⁰С на 2—3 сут. Подсчет колоний проводят на всей поверхности чашки. Считают, что из каждой живой клетки вырастает колония. Примерно на пло­щади 100 см в течение 5 мин оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха, а в 1 м³в 100 раз больше.

Загрязненность воздуха микробами можно оценить также фильтрационными методами. Один из них предложен Дьяковым. По этому методу определенный объем воздуха пропускают через стерильную питательную среду (мясопептонный бульон) или изо­тонический раствор натрия хлорида и стеклянные бусы. После тщательного перемешивания среды и проникших в нее микробов воздуха 1 мл такой смеси вносят в стерильную чашку Петри. Заливают расплавленным и охлажденным до 40—45⁰С мясопептонным агаром, среду равномерно распределяют вращательными движениями по дну чашки и оставляют до уплотнения. Чашки, перевернутые вверх дном, помешают в термостат при температуре 35—37⁰С. Через 2—3 сут подсчитывают выросшие колонии. Учи­тывая количество пропущенного воздуха и объем среды, опреде­ляют число живых микробных клеток в 1 м³воздуха.

Вместо жидкой среды для определения микробов в воздухе можно использовать сухие сыпучие вещества (порошок сахара), которым и заполняют стерильные стеклянные трубки. После про­пускания определенного объема воздуха через такую трубку по­рошок сахара растворяют в 5 мл стерильной воды и 1 мл получен­ного раствора высевают в чашку с мясопептонным агаром. Коли­чество микробов в 1 м ³определяют с учетом прошедшего воз­духа, разведения и объема высеянного раствора.

Количественный учет микробов в почве

Микроорганизмы в почве распределены неравномерно. Поэтому для их учета в этой среде взятые образцы смешивают в стерильной банке. Из средней пробы 1 г почвы переносят в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды (полу­чается разведение 10^-2, его готовят заранее). Из разве­дения 10^-21 мл переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (получа­ется разведение 10^-3) и т. д. Схема приготовления разведении:

1. 1 г почвы + 99 мл стерильной воды — 10 ^-2.

2. 1 мл разведения 10 ^-2-|- 9 мл стерильной воды— 10^-3

3. 1 мл разведения 10 ^-3+ 9 мл стерильной воды —10^-4.

4. 1 мл разведения 10 ^-4+ 9 мл стерильной воды — 10^-5

Из последних разведении по 1 мл вносят в стерильные чаш­ки, после чего заливают по 10—12 мл расплавленного и охлаж­денного до 45°С МПА, содержимое равномерно распределяют и оставляют на ровной поверхности. Чашки с застывшей средой переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Через 3—4 дня подсчитывают выросшие колонии, умножают на разведение и определяют количество живых микроорганизмов в 1 г сырой почвы.

Для пересчета на 1 г абсолютно сухой почвы ее высушивают до постоянной массы, устанавливают влажность и вносят поправку.

ЗАНЯТИЕ 9. Учёт результатов посева воды и воздуха. Коли-титр, коли-индекс. Санитарная оценка воды.

Цель занятия.Подсчитать колонии (в чашках Петри). Провести подсчет микробов из воздуха в разных комнатах, высеянных седиментационным методом по Коху. Ознакомиться с определе­нием коли-титра, коли-индекса и санитарной оценкой воды, а так­же с определением количества микробов в почве методом прямого счета под микроскопом.

Оборудование и материалы.Чашки Петри, в которые сделан посев воды и воздуха. Почва. Стерильная вода. Стерильная колба. Стерильные пипетки (10 мл) и микропипетки (0,1 мл). Предметные стекла. Крышки от чашек Петри. Окулярная сетка. Горелки, спички.

Для демонстрации хорошей и плохой воды: два ряда колб и пробирок со средой Булижа и высеянной в нее водой с коли-титром в первом ряду 0,1; во втором ряду— 100. Рост Е. coliна среде Эйкмана, РДА.

Определение коли-титра. Коли-титр — наименьшее количество воды (мл), в котором обнаруживается хотя бы одна кишечная палочка. Наличие кишечной палочки в воде указывает на загряз­нение ее содержимым желудочно-кишечного тракта. В отличие от других микроорганизмов воды, кишечная палочка может раз­виваться при температуре 43—46⁰С, легко сбраживает углеводы с образованием кислоты и газа. Это свойство микроба положено в основу определения коли-титра. Существует несколько методов определения коли-титра.

Определение коли-титра на среде Эйкмана. Исследуемую воду высевают на среду Эйкмана (пептон 1 г, натрия хлорид 0,5 г, глюкоза 0,5 г, водопроводная вода 100 мл, рН 7,4—7,6). При необходимости готовят концентрированную среду, для этого количество веществ, кроме воды, увеличивают в 10 раз. Глюкозу можно заменить лактозой или маннитом. Водопроводную воду, в зависимости от численности людей в населенном пункте, сеют:

а) в городах до 1 млн. человек в объеме 300 мл: два объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл;

б) в городах свыше 1 млн. человек в объеме 500 мл: четыре объема по 100 мл и десять объемов по 10 мл.

Чистую воду открытых водоемов сеют в количестве 100, 10 и 0,1 мл (1 мл воды, разведенной 10 ^-1 ); загрязненную—10, 1 и по 1 мл воды, разведенной 10^-1, 10^-2, 10^-3и т. д. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С и выдерживают в течение суток. Через 7—12 ч пробирки на время вынимают из термостата и делают пересев в розоловый дифференцированный агар (РДА). На РДА выращивают при 37 "С, и если имеется кишечная палочка, то через 12—17 ч среда желтеет, разрывается. Среда Эйкмана к этому времени (24 ч) мутнеет, образуется газ. При необходи­мости проводится идентификация Е.coli.

Состав РДА.МПА (рН 7,4—7,6) 100 мл, желчи 5 мл, лактозы 1 г, глюкозы 0,1 г, 1%-ного спиртового раствора индикатора бромтимолового синего и 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты по 0,2 мл. Среду разливают по 3—4 мл в пробирки и стерилизуют в течение 15—20 мин при температуре 112°С. Часть среды скашивают, так как посев делают уколом и на ско­шенную поверхность.

Посевы помещают в термостат на сутки при температуре 43°С. Рост сапрофитной микрофлоры при этой температуре подавляется. При наличии кишечной палочки она сбраживает маннит, индикатор (нейтральный красный) редуцируется, и среда принимает соломенно-желтое окрашивание, мутнеет, в «газовках» появляется воздух.

Для того чтобы убедиться, что изменения произведены ки­шечной палочкой, из пожелтевшей среды делают посев на среду Эндо. Посевы на среде Эндо помещают в термостат (37 °С) на сутки. Появление красных с металлическим блеском колоний, обнаружение при микроскопии грамотрицательных палочек и соответствующих изменений на цветном ряду подтверждают на­личие кишечной палочки.

Определение коли-индекса методом мембранных фильтров. Мембранные фильтры, употребляемые при исследовании воды, имеют различную проницаемость и разные номера. Наиболее часто применяют фильтр №3. Фабричные фильтры дважды кипятят в дистиллированной воде (в химическом стакане). Затем подготовленные бумажные фильтры накладывают матовой по­верхностью кверху на сетку асбестового фильтра Зейтца. Через фильтр пропускают определенное количество воды (до 500 мл, в зависимости от загрязнения). После фильтрации с помощью фламбированного пинцета фильтр кладут блестящей поверхностью на среду Эндо в чашки Петри. Чашки ставят в термостат при температуре 37°С или лучше при 43°С на сутки. На белой поверхности фильтров при наличии ки­шечной палочки появляются красные колонии, которые и подсчи­тывают. Методом мембранных фильтров определяют коли-индекс, то есть количество кишечных палочек, содержащееся в 1 л воды. Для перевода коли-титра в коли-индекс необходимо 1000 разделить на число, показывающее коли-титр. Для перевода коли-индекса в коли-титр 1000 делят на число, выражающее коли-индекс.

Пример. При коли-титре, равном 10, коли-индекс равен 100. При коли-индексе, равном 5, коли-титр равен 200.

Санитарная оценка воды.Согласно ГОСТ 2874—73 на питье­вую воду, общее количество микробов (микробное число) в 1 мл при посеве не разведенной воды и выдерживании ее в течение 24 ч при 37 °С должно быть не более 100. В 1 л воды при определении методом мембранных фильтров кишечных палочек должно быть не более трех. При использовании бродильных проб титр кишеч­ной палочки должен быть не менее 300. К водопроводной воде в городах с населением свыше 1 млн. человек должны предъявляться более высокие требования.

Вода открытых водоемов считается хорошей при коли-титре 100, коли-индексе 10. При коли-титре ниже 1 вода непригодна к употреблению. Следовательно, чем выше коли-титр, тем вода чище, лучше, и наоборот, чем ниже, тем качество ее хуже.

Для демонстрации плохой и хорошей воды открытых водоемов ее высевают на среду Булижа: в первый ряд — с коли-титром 100 и выше (вода хорошая); во второй—с коли-титром 0,1 и ниже (вода плохая). По изменению окрашивания среды (от мали­ново-красной до желтой) можно установить наличие кишечной палочки в определенном объеме исследуемой воды и ее качество.

Подсчет колоний в чашках Петри. На мясопептонном агаре в чашках Петри подсчитывают выросшие колонии из разведении 10 ^-2, 10^-1и не разведенной воды. После подсчета ко­лоний получаемый результат умножают на разведение и определяют среднее число. Качество воды оценивают по содержанию микро­бов в 1 мл:

Хорошая вода до 100

Сомнительная вода от 100 до 500

Плохая вода от 500 и более

Содержание микроорганизмов в воздухе разных комнат опре­деляют путем подсчета колоний на всей поверхности питательной среды чашки. В зависимости от количества выросших колоний делают заключение о микробной загрязненности воздуха в по­мещении.

Чистым воздух считается в том случае, если в 1 м ³летом содержится 1500, а зимой —4500 микроорганизмов; в загряз­ненном воздухе соответственно 2500 и 7000 микробов (по А. И. Шарифу).

Определение численности микробов в почве методом прямого счета.Наряду с другими методами число микробов в почве можно определить прямым подсчетом их под микроскопом. Такие методы разработаны С. Н. Виноградским (1952), Д. Г. Звягинцевым (1959) и другими исследователями. Подсчет микробов по Виноградскому проводят под обычным световым микроскопом, в то время как для выполнения подобной работы по Звягинцеву тре­буется флуоресцентный микроскоп, который может быть не в каж­дой студенческой лаборатории.

Метод прямого счета микробов под микроскопом, предложен­ный С. Н. Виноградским, имеет ряд достоинств, но он громоздок, поэтому его чаще применяют в модификации О. Г. Шульгиной. Он сводится к следующему. Из средней пробы отвешивают 5 г почвы и вносят в Эрленмейеровскую колбу объемом 250 мл. Почву заливают 50 мл стерильной воды, встряхивают в течение 5 мин, после чего в течение 1 мин отстаивают. Из колбы стерильной пипеткой берут 0,01 мл суспензии и распределяют ее на площади 4 см²предметного стекла (под стекло кладут очерченный квадрат такой же площади). После подсушивания препарат заливают тонким слоем 0,1%-ного водного раствора агара, вновь подсу­шивают, фиксируют 96 %-ным этиловым спиртом в течение 10—20 мин и окрашивают 1—2 мин фуксином основным феноловым Циля или другим красителем. Затем краситель сливают и смы­вают его путем погружения стекла до 5 раз в стакан с водой. Высу­шивают на воздухе. Количество клеток подсчитывают под иммер­сионным объективом микроскопа в 50—100 квадратах окулярной сетки, которую помещают на постоянную металлическую диафрагму между глазной и собирательной линзами окуляра. При объективе Х90 и окуляре XI0 сторона клетки окулярной сетки равна 0,02 мм, а ее площадь 0,0004 мм².

Расчет. При увеличении в 900 раз на площади в 1 см вмещается 25*10 ⁴ квадратов окулярной сетки (1 см² = 100 мм², 100 мм² :0,0004= 25*10⁴), а на 4 см

Для определения микробов в 1 г почвы необходимо среднее количество клеток в одном квадрате окулярной сетки умножить еще на 1000, так как в 0,01 мл суспензии содержится 0,001 г почвы. При наличии в квадрате окулярной сетки трех микробных клеток в 1 г почвы их будет 3*10 ⁹, при наличии пяти—5*10⁹ и т. д.

ЗАНЯТИЕ 10. Исследование микрофлоры кормов. Цель занятия.Ознакомиться с правилами взятия проб силоса для исследования. Определить микрофлору силоса № 1 и № 2: приготовление и микроскопия мазков; ознакомление с микробио­логическим исследованием силоса (посевы и учет основных физио­логических групп микроорганизмов на разных средах). Оценить качество силоса № 1 и 2 по А. Н. Михину.

Оборудование и материалы.Фарфоровые ступки с пестика­ми (стерильные). Предметные стекла. Краситель эритрозин. Горелки. Микроскопы. Кедровое масло. Силос № 1 и 2 в чашках. Вытяжки из силосов. Универсальный индикатор, пипетки. Фарфо­ровые чашки для определения рН. Стандарт (цветная шкала для определения рН). Весы и разновесы к ним. Чашки для взвешивания силоса. Пинцеты. Две банки с притертыми пробками. Банка с разведением силоса 1:10 (40 г силоса-360 мл стерильной воды). Шесть колб со сте­рильной водой по 90 мл в каждой. Пипетки для приготовления разведений (на 10 мл). Штатив с питательными средами: МПА - 5 пробирок, СА - 4, САМ (сусло-агар с мелом) - 6, молоко - 6, сусло пивное - 6, лактоза - 5, картофельная среда Рушмана -5 пробирок.

Микрофлора кормов во многом обусловлена температурой, влажностью среды и видовым составом растений. Она меняется во время заготовки и последующего хранения кормов. После скашивания нарушаются защитные функции растения, микробы проникают внутрь, используют питательные вещества и разру­шают ткани. В это время особенно бурно развивается гнилостная микрофлора, вызывая порчу кормов. Скошенные растения можно сохранить путем высушивания или силосования, когда недоста­точно свободной воды или создаются такие условия, при которых прекращается деятельность аммонификаторов. Наряду с заго­товкой сена и сенажа в кормопроизводстве многих хозяйств одно из первых мест занимает силосование.

В кормах могут быть обнаружены плесневые грибы, гни­лостные, масляно-кислые и другие микроорганизмы. Такие корма часто вызывают отравления, расстройство органов пищеварения и других систем. В результате исследования можно выявить причину порчи корма, устранить ее и тем самым предупредить заболевание животных.

Определение микрофлоры силоса. Взятие проб силоса. Пробы силоса необходимо брать в три срока: а) во время заклад­ки силоса для определения эпифитной микро­флоры; б) через 10—15 дней после закладки для определения микрофлоры созревшего силоса; в) при вскрытии силоса.

В общей массе силоса не во всех ее участках одинаково проходят микробиологические процессы, поэтому в башне берут три пробы силоса: первую и вторую — на расстоянии одного метра от верха и низа, третью — между ними. В траншеях, в зависи­мости от длины, берут две или три пробы на глубине одного метра от поверхности. В круглых ямах пробу берут в центре после снятия верхнего слоя, также на глубине одного метра. Пробы силоса помещают в стерильные банки с притертыми проб­ками.

Микроскопическое исследование силоса.В фар­форовой ступке (с небольшим количеством стерильной дистил­лированной воды) растирают кусочек силоса. Из растертой массы на предметном стекле пестиком делают мазок, затем его фикси­руют и окрашивают эритрозином. Мазок рассматривают под иммерсионной системой и зарисовывают. В хорошем силосе встречаются единичные палочки и кокки, в плохом силосе обнаруживается большое число кокков и палочек.

Микробиологическое исследование силоса проводят для выявления разных физиологических групп микро­организмов; молочнокислых, масляно-кислых, гнилостных, газообразующих, дрожжей и плесеней. Перед посевом готовят разведения. С этой целью на технических весах отвешивают 40 г силосной массы. Навеску с соблюдением правил стерильности переносят в стерильную банку с притертой пробкой, в которую налито 360 мл стерильной воды. Чтобы «отмыть» микроорганизмы, содержащиеся на поверхности растений, силос в банке взбалтывают в течении 10 мин на шуттель-аппарате или руками. В банке получается разведение 1:10. К этому времени должны быть готовы колбы со стерильной водой по 90 мл в каждой и сделаны надписи: II, III, IV, V, VI,VII. Последующие разведения готовят путем внесения 10 мл разведе­ния 1:10 во вторую колбу с 90 мл стерильной воды, в результате чего получается разведение 1:100. Из второй колбы 10 мл раз­ведения 1:100 переносят в третью колбу, получается разведение 1:1000 и т.д. Содержимое колбы перед взятием разведения силоса взбалтывают в течение 3 мин. После приготовления разведении готовят посуду (чашки Петри, пробирки), делают надписи.

Физиологические группы микроорганизмов определяют на следующих питательных средах:

МПА - гнилостную микрофлору.

СА - плесени и дрожжи.

САМ (с мелом) - молочнокислые бактерии,

молоке - молочнокислые бактерии,

лактозе - газообразующие (кишечные) бактерии,

картофельной среде Рушмана - масляно-кислые бациллы.

В приготовленную посуду и среды, начиная с последней колбы, вносят по 1 мл разведении: на МПА с I, II, III, IV, V разведениями; на СА с I, II, III, IV; на САМ со II, III, IV, V, VI, VII; на молоко с II, III, IV, V, VI, VII; на сусло пивное с II, III, IV, V, VI, VII; на лактозу с I, II, III, IV, V; на картофельную среду Рушмана с I, II, III, IV, V разведениями.

После охлаждения питательных сред до 50—45⁰С (а САМ и после тщательного взбалтывания) их вносят в чашки. Лег­кими вращательными движениями чашек смешивают разведе­ния силоса со средой и оставляют на ровной поверхности для застывания. Чашки, перевернутые вверх дном, выдерживают в термостате при температуре 30—35°С в течение трех суток. На четвертые сутки проводят учет физиологических групп микро­организмов. Численность разных физиологических групп микро­организмов на плотных питательных средах определяют путем подсчета колоний, на жидких питательных средах — путем обнаружения роста микробов из разных разведении, а на моло­ке — по свертыванию его. Та из свернувшихся сред, в которую было внесено наибольшее разведение, и будет определять коли­чество молочнокислых микроорганизмов в силосе. На плотных средах в чашках Петри подсчет ведут из трех разведении, в каждом из которых выросло не менее десяти колоний.

Оценка качества силоса.Органолептическая оценка силоса.Цвет должен быть ближе к цвету растений, из которых приготовлен силос. У доброкачественного силоса могут встречаться оттенки: желтый, желто-зеленый, коричнево-зеленый, светло-коричневый. У испорченного силоса преобладает коричневый цвет; обычно он бывает темно-коричневый, грязный. Запах доброкачественного силоса должен быть приятным, напоминающим запах плодов, хлебного кваса, моченых яблок. При порче силоса появляется запах уксуса. Испорченный силос имеет запах редьки, прогорклого масла, селедки, долго не исчезаю­щий при растирании кусочка силоса между пальцами. При наличии в силосе масляной кислоты растертый между пальцами силос издает неприятный запах навоза. Вкус доброкачественного силоса слабокислый, приятный. У испорченного силоса вкус резко кислый с горьковатым прив­кусом. Консистенция у доброкачественного силоса должна быть такой, какую имели исходные растения. У испорченного силоса расти­тельная масса делается ослизлой, мажущейся, листочки не от­деляются друг от друга.

Химическая оценка силоса.Приготовление вытяжки из силоса. В литровую банку (колбу) помещают 100 г мелко нарезанного силоса. В банку приблизительно до 3/4 объема нали­вают дистиллированную воду, тщательно взбалтывают и доливают до литра. Содержимое в течение 4—5 ч периодически взбалты­вают. Затем отфильтровывают и фильтрат используют для разных целей (например, для определения рН).

Определение рН силоса.Для определения рН силоса готовят две вытяжки: одну из хорошего силоса, другую — из заведомо недоброкачественного. Пипеткой в фарфоровую чашечку или углубление вносят 1 мл вытяжки и каплю универсального индика­тора. При смешивании жидкостей происходит изменение окраски вытяжки. Реакцию (рН силоса) определяют по стандартной шкале, которая нанесена на бумаге с защитным покрытием. По А. Н. Михину, в качестве индикатора используют смесь бромтимолового синего и метилового красного. В углубление фарфоровой чашки вносят 2 мл вытяжки и 2—3 капли смеси индикаторов. В зависимости от величины рН вытяжка приобретает разную окраску, которую находят по таблице.

Оценка качества силоса в баллах (по А. Н. Михину)

Параметры	РН	Балл
Определение рН силоса (окраска вытяжки после добавления индикатора): Красная Красно-оранжевая Оранжевая Желтая Желто-зеленая Зеленая Зелено-синяя	4,2 и ниже 4,2-4,6 4,6-5,1 5,1-6,1 6,1-6,4 6,4-7,2 7,2-7,6	5 4 3 2 1 0 0
Запах: Ароматично-фруктовый, слабокислый, хлебный Слабоароматный, уксуснокислый, огуречный Резко уксуснокислый, запах масляной кислоты Затхлый, навозный, сильный запах масляной кислоты	- - - -	4 3 2-1 0
Цвет силоса: Зеленый Коричневый или желто-зеленый Черно-зеленый Черный	- - - -	3 2 1 0

Данные балльной оценки при определении рН, запаха, цвета суммируют, получают общий балл, по которому и определяют качество силоса, баллов:

очень хороший 11-12

хороший 9-10

среднего качества 7-8

плохой 4-6

На практике рН силоса определяют также колориметрическим, электрометрическим и другими методами.

Силос, имеющий оценку 3 балла и ниже, считается очень плохим и к скармливанию животным непригоден.

Исследование силоса на присутствие в нем токсина ботулинуса. Силос часто загрязняется почвой, в которой наряду с другими микроорганизмами могут быть бациллы ботулинуса (Cl.botulinum). Такие микробы в силосуемой массе распределяются нерав­номерно, гнездно, то есть там, где имеется почва. Из подозри­тельных участков берут 1—2 кг силоса и помещают его в стерильные широкогорлые колбы. Пробы заливают двойным количеством стерильной воды и оставляют для экстрагирования. Затем часть воды и корма переносят в стерильную фарфоровую ступку и растирают. Выдерживают 1—2 ч и после этого фильтруют до получения прозрачной жидкости.

Наличие токсина ботулинуса в силосе определяют на морских свинках или белых мышах. Фильтрат делят на две части: одну из них нагревают до 80-100°С для разрушения токсина, другую оставляют без изменения. Опыт ставят на четырех свинках. Материал выпаивают при помощи шприца с конюлей или шприца без иглы. Двум животным дают по 2 мл прогретого фильтрата, остальным — такое же количество фильтрата, но не подвергавшегося термической обработке.

При содержании в непрогретом фильтрате токсина у животных появляются параличи задних конечностей, брюшных мышц и другие признаки, характерные для отравления. Морские свинки обычно в течение 2—3 сут погибают. Это дает основание (при отсутствии клиники болезни у контрольных животных, которым выпаивали прогретый фильтрат) считать, что в исследуемом материале имеется токсин.

Определение наличия токсина в силосе можно проводить и на белых мышах, при этом дозу фильтрата уменьшают до 0,5_1 мл. Отсутствие характерной клиники болезни не исключает наличие токсина ботулинуса в корме, поэтому исследование повторяют.