Методики контроля качества

Определение общей концентрации (густоты) микробных клеток

Пробу нативной культуры в количестве 0,5 мл разводят последовательно 10 кратным количеством 0,9 %-го раствора хлорида натрия. При этом отмечают количество разводок. Разведение проводят до уравнения мутности пробы с мутностью стандарта ГИСК им. Л. А. Тарасевича, определяемое визуально. Расчет концентрации проводят по формуле:

Х = 0,5 ^. 2 ^. 10ⁿ, где n – количество разведений

Определение количества живых микробов в нулевой и конечной пробах

Пробу нативной культуры в количестве 0,5 мл разводят последовательно 10 кратным количеством 0,9 %-го раствора хлорида натрия до 8 разведения (в нулевой пробе – до 7 разведения). Затем в мерную пипетку набирают 0,1 мл культуры и производят посев в чашку Петри с ППС.

Посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре (37±1) ⁰ С. По истечение указанного времени проводят подсчет выросших колоний. Расчет концентрации осущетсвляют по формуле:

Х = 0,1 ^. 10 ^. 8ⁿ , где n – количество разведений

ЗАВЕРШЕНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТ НА СТАДИИ

Всю стеклянную посуду, ферментер с остатками нативной культуры и вспомагательные матариалы «загрязненные» культурой стерилизуют в автоклаве при температуре (130 ± 1) ^оС в течение 2 ч.

МИКРОСКОПИЯ ПО ГРАМУ

Подготовка красок

Раствор метилвиолета. 10 г метилвиолета насыпают во флакон с притертой пробкой, наливают 100 мл 96 %-ного этилового спирта и дают этой смеси отстояться (2…3) сут. Раствор периодически (1 раз в день) перемешивают встряхиванием флакона. 10 мл спиртового раствора метилвиолета смешивают с 90 мл 5 %-ного водного раствора карболовой кислоты.

Раствор Люголя. В 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия, затем добавляют 1 г йода кристаллического. После растворения препаратов объем раствора доводят дистиллированной водой до 300 мл.

Карболовый фуксин Циля. 1 г порошка фуксина основного тщательно растирают с 5 г карболовой кислоты в фарфоровой ступке до получения гомогенной смеси, добавив 2…5 капель глицерина. Во время растирания добавляют небольшими порциями 10 мл 96 %-ного этилового спирта. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу без комков, добавляют 100 мл дистиллированной воды и перемешивают.

Дают отстояться полученной смеси двое суток, затем фильтруют через один слой фильтровальной бумаги. Раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой в течение 1 года при комнатной температуре.

Рабочий раствор фуксина Пфейфера. К 1 мл карболового фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды. Раствор хранению не подлежит, готовят по мере необходимости.

Проведение анализа

На бумажку наносят раствор метилвиолета на (1…2) мин. Краску с бумажки удаляют и препарат (1…2) мин обрабатывают раствором Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на (0,5…1,0) мин наносят 96 %-ный этиловый спирт. Далее мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают (1…2) мин рабочим раствором фуксина Пфейфера. После этого краску сливают, препарат промывают водопроводной водой и сушат фильтровальной бумагой. Мазок просматривают под микроскопом с использованием объектива 90х и окуляров 7х. Необходимо просмотреть не менее 50 полей зрения.

МЕТОДИКА ОТБОРА ПРОБЫ

Отбор пробы осуществляется с соблюдением правил асептики. Операция выполняется с соблюдением правила парности. Перед отбором зажечь пламя спиртовки и над пламенем слить остатки микробной культуры в емкость с 5 %-м раствором перекиси водорода. Затем при помощи зажимов Кохера освободить часть трубки от микробной культуры путем ее сильного накручивания на зажимы, расположенные на окончании трубки, и пережать еще одним зажимом. Скрутку отпустить. Ту же операцию провести и на трубке пробоотборника. Над пламенем спиртовки один оператор удерживает сначала трубку от емкости с микробной культурой, а второй – ножницами отрезает у окончания трубки зажимы и убирает их в емкость с дезраствором. Затем второй оператор подает трубку от пробоотборника в руку первому и проводит ту же операцию. Первый соединяет обе трубки через штуцер над пламенем спиртовки. Далее отбирается проба, предварительно освободив трубку от всех зажимов, в необходимом количестве (20…40 см³). Затем трубка пережимается 4-я зажимами с небольшим промежутком между парами. Берутся салфетки, смоченные дезраствором, прокладываются: одна – снизу трубки, вторая – сверху. Между ними помещаются ножницы и перерезают трубку. Салфетки пережимаются на разных концах вторыми (от края) зажимами.

МЕТОДИКА ЗАСЕВА МАТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

Операция проводится с соблюдением правил асептики и парности в работе. Все присоединения емкости с маточной культурой к аппарату производятся в соответствии с «Методикой отбора проб».

Введение маточной культуры в аппарат можно выполнить путем вакуумирования аппарата, либо путем создания небольшого давления (через редуктор) в емкости с маточной культурой. После введения маточной культуры в аппарат необходимо провести промывку трубок стерильной дистиллированной водой. Все соединения проводятся в соответствии с «Методикой отбора проб». Введение пеногасителя в аппарат производится аналогично вышеописанному.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ (рН)

Операция проводится в вытяжном шкафу. Перед определением рН прибор должен быть включен не менее, чем за 15 минут. Необходимо проверить: наличие калия хлористого в электроде; его чистоту, а при наличие пленки – промыть ацетоном или 1 %-ным раствором соляной кислоты. Затем проверить рН-метр по буферному раствору (рН=6,86 ед.рН).

Перед проверкой электроды промыть дистиллированной водой, высушить фильтровальной бумагой. Пробу налить в стаканчик и поставить под электроды. Точные показания будут через 3 минуты. По окончании замера стаканчик убрать из под электродов и поместить в емкость с дезраствором на 3 минуты, затем промыть их дистиллированной водой. Электроды в процессе хранения должны постоянно находиться в дистиллированной воде.

МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО ГРАММУ

Определение проводят в вытяжном шкафу. На предметное стекло наносят 0,1 см³ микробной культуры с помощью пипетки. На предметном стекле равномерно распределяют пробу и оставляют досушиваться в шкафу на воздухе приблизительно на 20 минут. Затем мазок фиксируют над пламенем спиртовки путем 4-5-ти кратным разведением. Далее по методике, описанной в «Методических указаниях» со слов: «На бумажку…».

МЕТОДИКА РАСЧЕТА ПЛОТНОСТИ ПОСЕВА

Для того, чтобы узнать, какое количество посевного материала необходимо ввести в аппарат, необходимо знать:

1 концентрацию приготовленного ПМ, млрд.кл. в см³;

2 объем ЖПС дм³.

Согласно «Методических указаний …» плотность посева должна составлять 400…600 млн. микробных клеток в см³. Расчет необходимого количества МП проводится по следующим формулам:

Спм

С1 = ----------- (1)

Vжпс

ПД

Vпм = --------- (2)

С1

где: С1 – концентрация ПМ после разведения ЖПС, млрд.кл. в см³;

Vжпс – объем питательной среды, дм³;

Спм – концентрация приготовленного ПМ, млрд.кл. в см³;

ПД – необходимая плотность посева, млрд.кл. в см³;

Vпм – объем посевного материала, см³ или дм³.