Приготовление очищенного формалина

В коническую колбу вместимостью 2,0 дм³ мерно наливают формалин, добавляют древесный уголь марки А из расчета 10 г на 1 дм³ формалина. Полученную смесь кипятят в водяной бане в вытяжном шкафу в течение 1 ч с момента закипания. После охлаждения смесь фильтруют через фильтр “синяя лента”. В полученном формалине с помощью ареометра определяют плотность и по справочной таблице – соответствующую концентрацию формалина. Концентрация формалина должна быть не ниже 36 %. Приготовленный раствор формалина переливают в стерильную бутыль со стеклянной притертой пробкой. Всего готовят 0,5...1 дм³ формалина.

Приготовление 2-3% раствора формалина

Для приготовления 6 дм³ 2-3% раствора формалина необходимо взять 0.5 дм³ очищенного формалина 6 дм³ дистиллированной воды и смешать. Полученный водно-формалиновый раствор хранится в бутыли объемом 10 дм³ под пробкой.

Приготовление 5-7% раствора перекиси водорода

Для приготовления 6 дм³ 5-7% раствора перекиси водорода необходимо взять 1дм3 перекиси водорода 5 дм³ дистиллированной воды и смешать. Полученный раствор хранится в бутыли объемом 10 дм³ под пробкой.

Работа 3. Подготовка установки «Сартокон-мини» к работе

Извлечь модуль из упаковки. Поставить его между подвижной и неподвижной пластинами на две направляющие штанги из нержавеющей стали. При монтаже в прибор только одного модуля уплотнение не требуется. При монтаже нескольких модулей проложить между модулями уплотнение из нержавеющей стали, поставляемого вместе с модулями. Проследить за тем, чтобы уплотнение хорошо прилегало к модулям.

Завернуть от руки гайки зажимных болтов настолько, чтобы модуль фиксировался передней или задней панелью. Затяжка гаек на стягивающих шпильках произвести динамометрическим ключом с фиксированным усилием затяжки 50 Нм. При прощелкивании механизма ключа затяжку ключа необходимо прекратить. Гайки следует затягивать попеременно для предотвращения перекосов мембранных модулей и для оптимального уплотнения.

Полностью смочить мембранные модули путем циркуляции 5 л дистиллированной воды в течение 10 мин. Гидрофобные мембраны на основе полиолефина модулей «Микросарт» необходимо смачивать путем циркуляции нескольких литров спирта в течение 10 минут.

Вывести воду из системы, включив насос на короткое время без подачи жидкости / максимальное давление 0.1 МПа /. Смоченные спиртом полиолефиновые мембраны можно промыть путем циркуляции 10 л дистиллированной воды. Следует избегать закачивания в смоченные полиолефиновые мембраны воздуха.

Проверить неразрушающее испытание на целостность фильтрующего элемента. С этой целью:

закрыть один выход пермеата (фугата), другой выход пермеата снабдить шлангом. Ввести конец шланга вниз перевернутой заполненной водой бюретки, находящейся под водой в химическом стакане, заполненном водой. Создать на входе ретентата (концентрата) давление 0.1 МПа / исключение: в модулях Микросарт SM 3031230601W это давление должно составлять 0.3 МПа /. Для модулей Микросарт через 4 минуты /время стабилизации/ диффузия воздуха через модуль, смоченный водой, при давлении 0.1 МПа со стороны ретентата должна составлять не более 5 мл/мин/модуль.

Дезинфицировать систему «Сартокон-мини» путем циркуляции 3-5 л дезинфицирующего раствора / 2-3% раствор формалина / в течение 30-40 минут. Модули допускается дезинфицировать следующими растворами:

2-3% - ным раствором формалина

5-7% - ной перекисью водорода

0.1 % - ой перуксусной кислотой

0.1% - ным натровым азидом.

После завершения дезинфекции с соблюдением правил асептики под пламенем спиртовки к линии ретентата подсоединить бутыль со стерильной дистиллированной водой, а к линии пермеата – пустую стерильную бутыль для сбора промывной воды. Промыть систему 10 – 15 л стерильной дистиллированной водой для удаления дезинфектанта из модулей.

Работа 4. Микрофильтрация

По окончании удаления дезификтанта из системы, соблюдая правила асептики под пламенем спиртовки бутыли отсоединить и систему подсоединить к рабочему раствору как показано на рисунке 6.

На входе и выходе ретентата «Сартокон-мини» установлены мембранные манометры, которые измеряют давление ретентата на входе и на выходе. Давление в системе создается с помощью изменения скорости вращения насоса или при помощи вентиля на линии выхода исходного раствора.

Среднее давление Рм при помощи вышеуказанных манометров можно рассчитать следующим образом:

Р м =(Ре + Ра)/2

Ре – давление на входе, МПа

Ра – давление на выходе, МПа

Оптимальное среднее значение давления зависит от исходного раствора.

По мере роста среднего значения давления производительность фильтрации увеличивается. Следует учитывать то, что при фильтрации таких веществ как бактерии, протеины, концентрированные растворы среднее давление нельзя как угодно увеличивать. Это приводит к денатурации и разложению этих веществ, создает условия для концентрационной поляризации и снижает производительность фильтрации. Сильная концентрационная поляризация затрудняет очистку модуля, сокращает срок эксплуатации.

После фильтрации промыть систему 5-10 л дистиллированной воды для удаления остатков фильтруемой среды из модулей, прокачать очищающий раствор «Ультрасил-53» для модулей из ацетат, триацетат целлюлозы и «Ультрасил-11» для модуле из полипропилена и полисульфона в течение 15-30 минут при Рм равном 0.15 МПа.

Промыть систему от очищающего раствора 15 л дистиллированной воды и дизенфецировать как описано выше. Модуль, заполненный дезинфецирующим средством, допускается оставлять несколько дней или недель в системе. Если модуль не используется в течение длительного времени. Его следует хранить заполненным дезинфицирующим средством /преимущественно формалином/ при температуре 30 ^оС максимум в запаянном пластиковом пакете. Не следует использовать для длительной консервации перекись водорода.

1

3

2 6

4 5

7

1 – емкость с исходным раствором; 2 – линия подачи и вывода исходного раствора; 3 – линия вывода фильтрата; 4 – насос; 5 – мембранный модуль; 6 – емкость с целевым продуктом (фильтратом); 7 – манометры.

Возврат фильтрата

Р

исунок 6 - Подсоединение системы «Сартокон-мини»

к емкости хранения

Работа 5. Оценка качества концентрированного колибактерина

Приготовление осмотически активных растворов

а). Фосфатный буфер готовят на основе растворов солей однозамещенного и двузамещенного фосфорнокислого калия по следующей схеме:

- 228,23 г двузамещенного фосфорнокислого калия (К₂НРО₄3Н₂О) растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в дистиллированной воде и доводят объем до одного литра – раствор соли двузамещенного фосфорнокислого калия;

- 136,09 г безводного однозамещенного фосфорнокислого калия (КН₂РО₄) растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в дистиллированной воде и доводят объем раствора до одного литра – раствор соли безводного однозамещенного фосфорнокислого калия.

Приготовленные растворы солей можно хранить в закрытой стеклянной таре при температуре 2…4⁰С в течение 30 сут.

После полного растворения солей в обеих мерных колбах градуированной пипеткой вместимостью 10 мл отбирают 21,1 мл раствора К₂НРО₄3Н₂О, 6,4 мл раствора КН₂РО₄ и добавляют к одному литру дистиллированной воды. После перемешивания компонентов отбирают пробу для контроля величины рН, которая должна быть в пределах (7,3…7,6) ед.рН. Полученный раствор фосфатного буфера можно хранить при температуре (18…25)⁰С в течение 24 ч.

б). Гипертонический раствор хлористого натрия готовят, используя фосфатный буфер в качестве растворителя.

73 г хлористого натрия растворяют в 927 мл фосфатного буфера. После перемешивания отбирают пробу для определения величины рН, которая должна быть в пределах (6,80,2) ед.рН.

Раствор расфасовывают по 0,8 и 2, 5 л в одно- и трехлитровые бутылки с сифоном и закрывают ватно-марлевыми пробками. Гипертонический раствор хлористого натрия можно хранить при температуре (2…4)⁰С до 10 сут.

в). Раствор сахарозы готовят, используя фосфатный буфер в качестве растворителя:

84 г сахарозы растворяют в 916 мл фосфатного буфера. После перемешивания отбирают пробу для контроля величины рН, которая должна быть в пределах 7,3…7,5 ед.рН. Раствор расфасовывают по 0,8 и 2,5 л в одно- и трехлитровые бутылки с сифоном или закрывают ватно-марлевыми пробками. Раствор сахарозы можно хранить при температуре (2…4)⁰С 10 сут.

Раствор хлорида натрия с концентрацией 0,85 % готовят по следующей схеме. Хлорид натрия в количестве (8,50,1) г растворяют в (9910,1) мл дистиллированной воды. После тщательного полного растворения соли к одному литру раствора градуированной пипеткой добавляют 20,0 мл К₂НРО₄3Н₂О и 8,0 мл раствора КН₂РО₄, Тщательно перемешивают полученный раствор и отбирают пробу для контроля величины рН, которая должна быть 7,00,2.

Примечание. Перед использованием раствор сахарозы и гипертонический раствор хлористого натрия проверяют на прозрачность. Для этого измеряют оптическую плотность приготовленных осмотически активных растворов на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10 мм и светофильтром № 6 (зеленый, =54010 нм) относительно дистиллированной воды. Экстинкция гипертонического раствора хлористого натрия и раствора сахарозы должна быть не выше 0,02 ед.экст. В случае получения мутных растворов и отличий величины рН осмотически активные растворы готовят заново.

Проведение анализа

Разлить растворы хлорида натрия (17,3 %) и сахарозы (8,4 %) по 4 мл с точностью 0,1 мл в пробирки. На одну пробу подготовить по 6 пробирок каждого раствора и 3 мерные колбы с физиологическим раствором хлорида натрия (0,85 %). Пробу колибактерина развести параллельно в 3-х мерных колбах с физиологическим раствором хлорида натрия (0,85 %) в 10 раз. (Например, мерную колбу вместимостью 50 мл наполнить примерно на 2/3 физиологическим раствором хлорида натрия (0,85 %), ввести в колбу 5 мл колибактерина, тщательно перемешать и добавить физиологический раствор хлорида натрия (0,85 %) до метки и снова перемешать). Пробу исследуемой суспензии развести параллельно в 3-х мерных колбах физиологическим раствором хлорида натрия (0,85 %) в 100 раз. (Например, мерную колбу вместимостью 100 мл наполнить примерно на 2/3 физиологическим раствором хлорида натрия (0,85 %), внести в колбу 1 мл суспензии, тщательно перемешать, добавить физиологический раствор хлорида натрия (0,85 %) до метки и снова перемешать).

Градуированной пипеткой вместимостью 1 мл отобрать из средней части первой колбы по 1,00,05 мл разведенной пробы и перенести ее в пробирки с раствором хлорида натрия и в две пробирки с сахарозой. То же самое проделать со второй и третьей колбами. Подготовить три ряда пробирок, содержащих по 2 параллельные пробы каждого раствора. Пробирки закрыть ватно-марлевыми пробками и перемешать.

Измерить экстинкцию (оптическую плотность) полученных суспензий на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной оптического пути 10 мм с зеленым светофильтром (=540 нм). В качестве сравнительной пробы использовать дистиллированную воду. Измерения должны быть закончены не позднее 30 мин с момента приготовления разводок в пробирках с сахарозой и хлоридом натрия. При фотометрировании проб ополаскивание кювет водой или растворами не производить. За результат принимают среднее арифметического не менее трех параллельных определений.

Обработка результатов

Концентрацию живых микробов рассчитывают по формуле:

БК = 2,2Еn ,

где БК – концентрация живых микробов, млрдмл^-1;

Е – разность экстинкций проб в растворах хлорида натрия и сахарозы, ед.экст.;

n – кратность разведения культуры, суспензии в мерных колбах и пробирках;

2,2 - коэффициент пересчета для концентрированной суспензии.