Создание новых плазмидных векторов

1 этап – назовем его рестрикцией – связан с обработкой эндонуклеазой рестрикции какого-то известного источника ДНК – возможно этим объектом будет какая-то уже известная плазмидная конструкция.

Рестриктаза – это эндонуклеаза, узнающая какую-то последовательность внутри цепи ДНК (сайт рестрикции, см. выше) и проводящая гидролиз (разрыв) этой цепи. Сейчас насчитывается 5 классов этих ферментов.

1. Рестриктазы класса 1 разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью.

2) ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы.

• В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Название фермента отражает название микроорганизма, из которого его выделяют.

Желательно, чтобы этот объект подвергся гидролизу в одном месте (сайте рестрикции), какой-либо рестриктазой.

Тем же ферментом (это очень важно) «вырезают» нужный ген (или участок ДНК, содержащий этот нужный – целевой ген) из какого-то другого плазмидного вектора. Если этот нужный участок не очень велик, то его можно синтезировать (что конечно, более затратно), оснастив соответствующими «концами» (окончаниями) с обеих сторон).

Так как действовали в обоих случаях одними и теми же ферментами (т.е. ферментами, узнающими и расщепляющими одни и тем же специфические нуклеотидные последовательности (сайты) в двуцепочечной молекуле ДНК, то выполняется важное в молекулярном клонировании обстоятельство о совпадении «концов» принимающей информацию молекулы ДНК и внедряемого фрагмента ДНК.

Гидролиз («расщепление») молекулы ДНК в нужном сайте эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) «липких» концов или (прямых) «тупых» концов.

II этап – встраивание фрагментов в принимающую ДНК и лигирование. Проводится совместное выдерживание «разрезанной» плазмидной ДНК и участка, содержащего интересующий исследователя ген в течение определенного времени в необходимых термальных условиях. В результате этого становится возможным объединение плазмиды и гена при помощи фермента ДНК-лигазы, который их как бы «сшивает», образуя ковалентные фосфодиэфирные связи. Возникает новая рекомбинантная плазмидная ДНК (новый вектор).

Полученный новый вектор выдерживается в течение определенного времени совместно с микроорганизмами-реципиентами. В целом ряде случаев плазмида-вектор внедряется внутрь клеток. Этот процесс носит название – трансформация. Для отбора трансформированных клеток смесь (протрансформированных и непротрансформированных) микроорганизмов высевают на среду, содержащую соответствующий фактор селективности (например, тот же антибиотик, ген устойчивости к которому был в плазмиде). Выросшие на селективной среде колонии проверют на способность к синтезу нужного биологического объекта.

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

1) наличию нескольких сайтов для клонирования;

2) возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется E.coli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность E.coli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов E.coli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов – полиленкер.

Эффективными методами трансформации E.coli плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

По подобной схеме были получены многие продуценты лекарственных средств, перечисленные выше.