2.Методы диагностики хромосомных болезней.
2.1.Пренатальная диагностика
Пренатальная диагностика - это комплекс методов, направленных на диагностику морфологических, структурных, функциональных или молекулярных нарушении развития, проявляющихся в виде изолированных или множественных врожденных уродств, дисрупций, деформаций, недоразвитии, хромосомных или моногенных болезней, в пороках или дисфункциях жизненно важных систем, органов и тканей, приводящих к тяжелым, нередко смертельным заболеваниям в постнатальном периоде.
Методы пренатальной диагностики.
Непрямые методы
Биохимический скрининг
К маркерным соединениям в крови матери относятся альфа-фетопротеин (АФП), хорионический гонадотропин (ХГ), свободный (неконъюгированный) эстриол (НЭ) и некоторые другие.
Все они являются эмбрионспецифичными, т.е. продуцируются клетками самого плода пли плаценты и поступают в кровоток матери. Их концентрация в сыворотке крови меняется в зависимости от срока беременности и от состояния плода.
АФП - основной компонент фетальной сыворотки на ранних стадиях беременности. Структурно схожий с альбумином белок (молекулярная масса около 70000 Да) вырабатывается желточным мешком и печенью плода. Белок экскретируется в амниотическую жидкость с мочой плода, проникает в кровь матери через плаценту и всасывается через плодные оболочки.
Белок выявляется в крови матери, начиная с 5-6 недель. Открытые дефекты заращения невральной трубки (ДЗНТ) ведут к излитию фетальной жидкости в амниотическую полость, вследствие чего резко возрастает концентрация АФП в крови матери. Поэтому повышение уровня АФП в материнской сыворотке во 2-м триместре беременности с высокой степенью вероятности указывает на наличие ДЗНТ у плода. Существенные повышения уровня АФП в крови матери наблюдаются также при других патологических состояниях плода (гастрошизис, аномалии почек), угрозе прерывания беременности и пр. В то же время в 30% случаев хромосомных нарушений у плода (болезнь Дауна (БД)) уровень АФП в диагностические сроки (15-20-я недели беременности) оказывается сниженным.
Хорионический гонадотропин (ХГ) - гликопротеин с молекулярной массой около 46000 Да, состоящий из двух субъединиц - альфа и бета. Белок секретируется клетками трофобласта. ХГ выявляется в сыворотке крови женщины, начиная с 10-12 дня после оплодотворения, т.е. на 3-5 день после имплантации. Его концентрация быстро нарастает и достигает максимума к 8-10 неделям беременности. Уровень ХГ при синдроме Дауна (трисомия хромосомы 21) у плода обычно повышается, а при трисомии хромосомы 18 (болезнь Эдвардса) - снижается.
Неконъюгированный эстриол (НЭ) - продуцируется фето-плацентарным комплексом. Дегидроэпиандростерон (ДГЭАС) превращается в альфа-гидрокси-ДГЭАС в печени плода и затем в эстриол в плаценте. Эстриол проникает в материнский кровоток, где можно определить концентрацию его неконъюгированной формы. Именно этот компонент имеет фетальную природу, и по его концентрации в сыворотке крови беременной можно судить о состоянии плода. В норме уровень НЭ нарастает от 4 нмоль/л в 15 недель беременности до 40 нмоль/л к родам.
Для проведения скрининга необходимо начать с определения уровня белка для данного срока беременности в норме. Биохимический скрининг для выявления ДЗНТ и БД проводят при сроке беременности 15-20 недель, причем эффективность выявления хромосомных аберраций максимальна на 15-18 и снижается при 19-20 неделях. При использовании "тройного теста" в сыворотке крови беременной определяют уровень АФП, ХГ и НЭ. Чаще используют в качестве маркеров хромосомных нарушений два белка - АФП и ХГ, так как тест-системы на НЭ обычно содержат радиоактивную метку и их применение ограничено наличием изотопного блока. Уровень выявляемости хромосомных нарушений при исследовании двух белков и эстриола по сравнению с определением двух маркерных белков повышается на 4-5%.
Поскольку абсолютные значения содержания белка могут зависеть от используемых тест-систем и региона страны, общепринятым обозначением для отклонения уровня белка от нормы стала кратность медиане (медиана - среднее в ряду упорядоченных по возрастанию значений уровня белка при нормальной беременности данного срока) - Мом (multipies of median) - например, уровень АФП = 2,5 Мом означает, что содержание белка в сыворотке данной беременной в 2,5 раза выше, чем медиана (норма) для этого срока беременности.
Нормальными значениями в диагностические сроки считаются уровни белков от 0,5 до 2 Мом.
Следует иметь в виду, что самой распространенной причиной ложноположительных результатов скрининга бывает неверный подсчет срока беременности, поэтому при несоответствии уровня белка норме необходимо, в первую очередь, уточнить срок беременности с помощью УЗИ.
На большом статистическом материале установлено, что средний уровень АФП при беременности плодом с трисомией 21 (БД) составляет 0,7 Мом, ХГ - 2 Мом, НЭ - 0, 75 Мом. При синдроме Эдвардса (трисомия 18) уровень АФП равен 0,7 Мом, ХГ - 0,7 Мом и НЭ - 0,7 Мом .
Числовые результаты биохимического скринирования так же, как и другие параметры (например, ультразвуковые маркеры хромосомных болезней), можно ввести в программу, которая с помощью методов статистического анализа оценивает риск хромосомных нарушений у плода. Существуют разные варианты компьютерных программ, которые наряду с возрастным риском используют для вычислений анамнестические и биохимические данные.
Показанием для применения инвазивной ПД с целью кариотипирования плода обычно считается риск выше чем 1:250 (от 1:190 до 1:400 в разных странах) на момент рождения ребенка.
Итогом биохимического скрининга является отбор беременных высокого риска рождения детей с ДЗНТ и с хромосомными болезнями плода. Таким беременным необходима иивазивная ПД. В случае высокого риска ДЗНТ у плода показано ультразвуковое сканирование с последующей инвазивной процедурой - амниоцентезом и анализом амниотической жидкости на содержание АФП и наличие специфической изоформы ацетилхолинэстеразы, характерной для плодов с ДЗНТ. При отклонениях маркерных белков, свидетельствующих о возможности хромосомных болезней у плода, проводится инвазивная процедура с целью кариотипирования плода. При проведении скринирующих исследований беременную следует информировать о возможности получения квалифицированной интерпретации результатов лабораторного анализа и обеспечить в случае необходимости ее направление на дальнейшую диагностику.
При массовом скрининге число беременных, которым показана инвазивная процедура, обычно составляет около 5% от общего количества обследованных. Важно понимать, что положительные результаты (экстремальное отклонение уровня белков от медианы) скрининга - только сигнал к более глубокому обследованию данной пациентки, т. к. хромосомная патология будет обнаружена примерно у одной из пятидесяти беременных этой группы, а ДЗНТ - у одной из четырехсот обследованных.
Последние 5 лет исследователи многих стран заняты поиском сывороточных маркеров в крови беременных, которые позволяли бы формировать группу риска рождения детей с болезнью Дауна уже в первом триместре беременности. Наиболее эффективными биохимическими показателями в первом триместре считаются свободная бета-субъединица хорионического гонадотропина и ассоциированный с беременностью белок А (pregnancy associated plasma protein А) - РАРР-А. Важным дополнительным УЗ маркером является также толщина воротникового пространства (ТВП) на сроке беременности 10-14 недель. Если рассчитать совокупный риск по измерению ТВП и биохимическим маркерам, то эффективность выявления БД у плода может достигать 80-90%.
Прямые методы
УЗ-сканирование плода (УЗ-диагностика)
Исследование состояния плода с помощью ультразвукового аппарата является одним из основных методов ПД. УЗ исследование позволяет выявить 80-98% плодов с анатомическими пороками и в настоящее время широко используется в нашей стране для скрининга патологии беременности. Метод особенно информативен на сроке 18-20 недель беременности.
Эффективность УЗИ во многом зависит от разрешающей способности УЗ-аппарата, опыта акушера-оператора и уровня обследования.
Стратегия ультразвуковой диагностики
В соответствии с рекомендациями Европейской Ассоциации по Перинатальной Медицине в большинстве стран Европы принята следующая стратегия:
Каждой беременной рекомендовано трех- четырехкратное УЗИ плода (на уровне 1).
Основное исследование с целью выявления пороков развития проводится на 20-22 неделях беременности (уровень 2).
Беременные групп высокого риска должны быть определены на первом уровне скрининга и более детально обследованы на втором уровне.
Обследованию на третьем уровне подлежат беременные с неоднозначными результатами, полученными на низших уровнях, особенно при подозрении аномалии развития сердца и мозга у плода.
Следует отметить, что основное назначение всех непрямых методов, а также УЗИ - отбор женщин групп высокого риска, нуждающихся в дальнейшем детальном наблюдении.
Инвазивные методы
Под инвазивными методами ПД следует понимать внутриматочные вмешательства при ультразвуковом мониторинге в операционных условиях с целью получения плодного материала для последующего гистологического, биохимического, цитогенетического или молекулярного анализов.
Клетки амниотической жидкости
Клетки амниотической жидкости (КАЖ) представлены несколькими типами различного происхождения:
собственно амниоциты, т.е. слущенные клетки амниотической оболочки плода,
эпителиальные клетки и фибробласты кожи, кишечника и ротовой полости плода.
Большая часть из них нежизнеспособна, остальные могут пролиферировать путем митотического деления и образовывать колонии в культуральных условиях.
Существует два основных метода культивирования КАЖ различающихся по способу получения колоний и методам фиксации:
Flask-метод - культивирование клеток во флаконах и фиксация суспензии монослойной культуры после трипсинизации. Анализ проводят в двух из трех культур (по 10 метафаз для каждого образца). Если во всех метафазах наблюдается одинаковый кариотип, диагноз считается установленным. В случае обнаружения единичной метафазы с аберрантным кариотипом (числовым или структурным), анализируется резервная третья культура. Если одна и та же хромосомная аберрация определяется в более чем одной метафазе из одного флакона, но не подтверждается в остальных флаконах, устанавливается диагноз "псевдомозаицизм". В случае обнаружения одной и той же хромосомной аномалии в более чем одном флаконе, устанавливается диагноз "истинный мозаицизм".
Метод in situ - культивирование и фиксация клеток на покровных стеклах в чашках Петри или в специальных флаконах-слайдах. Анализ проводят по метафазным пластинкам из трех культуральных чашек (всего анализируют 10 колоний). При выявлении аномального клона анализируют все культуры. Хромосомная аберрация, наблюдаемая лишь в одной чашке, свидетельствует о "псевдомозаицизме", более чем одной в - об истинном мозаицизме.
Клетки ворсин хориона (плаценты)
Клетки ворсинчатого хориона (плаценты), доступные для цитогенетического анализа, имеют различное происхождение:
клетки цитотрофобласта, дифференциация которого происходит на стадии зародышевого пузырька (бластоцисты);
клетки мезенхимы, дифференцирующиеся во внутриклеточной массе зародыша на стадии бластоцисты.
Для хромосомного анализа по клеткам хориона или плаценты используют два основных метода:
"Прямой", основанный на анализе спонтанных митозов клеток цитотрофобласта. Известны многочисленные модификации метода, предложенного впервые в 1983 г. Брамбати и Симони , главными из которых являются два:
непосредственная фиксация клеток и
фиксация после кратковременной (24-48 ч) инкубации ворсин в культуральной среде с питательными добавками.
Анализируют по 11-20 метафазных пластинок.
Длительное культивирование в монослойной культуре, основанное на анализе клеток мезенхимы. Основные принципы анализа и интерпретации результатов аналогичны описанным выше для культур КАЖ.
Диагностические проблемы, обусловленные анализом клеток хориона (плаценты), обсуждены в следующем разделе.
Лимфоциты крови плода
Для хромосомного анализа крови плода используют стандартную методику стимулирования лимфоцитов фитогемагглютинином (ФГА). Анализируют обычно 11-20 метафазных пластинок.
Этот метод дает наиболее адекватное представление о хромосомном статусе плода и настоятельно рекомендуется для кариотипирования плода в случае хромосомного мозаицизма в плаценте, а также при наличии пороков развития не только во 2-м, но, как показывает наш опыт,- и в 3-м триместре беременности. В последнем случае кариотипирование плода позволяет разрешить вопрос о тактике ведения беременности, родов и неонатального периода.