Методи імунологічного дослідження

І. Дослідження неспецифічного (природженого) імунітету:

Характеризують роботу імунної системи загалом. Не спрямовані для виявлення конкретних збудників, клітин чи АТ. Після аналізу орієнтувальних тестів лікар вирішує, чи є необхідність продовжити уточнювальні тести.

1) орієнтувальні тести (І рівня);

2) уточнювальні тести (ІІ рівня).

ІІ. Дослідження специфічного (набутого) імунітету.

Призначені для визначення специфічних АГ, які належать конкретним збудникам, і специфічних АТ, спрямованих проти конкретних АГ.

1) До орієнтувальних тестів (і рівня) належить визначення:

• загальної кількості лейкоцитів;

• абсолютного і відносного вмісту лімфоцитів;

• фагоцитарної активності лейкоцитів (фагоцитарний показник – кількість мікробів, захоплених однією клітиною; фагоцитарний індекс – процент клітин, що беруть участь у фагоцитозі);

• вмісту імуноглобулінів класів А, М, G;

• титру комплементу.

2) До уточнювальних тестів (іі рівня) належить визначення:

• субпопуляцій Т-лімфоцитів (хелпери, супресори, їх співвідношення Тх/Тс – імунорегуляторний індекс);

• кількості Т-активних лімфоцитів;

• кількості В-лімфоцитів;

• активності NK-клітин;

• компонентів комплементу;

• вмісту імуноглобулінів Е та інші.

Для визначення специфічних АГ чи АТ використовують групи методів:

• преципітації (утворення осаду з нерозчинних комплексів АГ-АТ в розчині, гелі, агарі; напр., визначення рівня імуноглобулінів за методом Манчіні);

• аглютинації (осадження імуноглобулінами клітин, навантажених АГ; напр., визначення груп крові, діагностика імунологічного безпліддя);

• лізису (споживання комплементу у двох парних системах АГ-АТ; напр., визначення рівня АТ до вірусів поліомієліту, герпесу, реакція Васермана);

• радіоімунний (визначення АГ чи АТ шляхом детекції комплексів, мічених радіоактивним йодом; напр., визначення вмісту гормонів, АТ до них);

• імунофлюоресцентний (визначення АГ чи АТ шляхом детекції флюоресціюючих комплексів; напр., визначення популяцій імуноцитів);

• імуноферментний (ELISA) (визначення АГ чи АТ шляхом їх взаємодії, відповідно, з АТ чи АГ, міченими ферментами, що приводить до зміни забарвлення).

Вікові особливості функціонування імунної системи.

Становлення імунної компетенції розпочинається на ранніх етапах ембріонального розвитку і є процесом генетично детермінованим.

Імунний статус новонародженого залежить, перш за все, від імуногенетичних особливостей матері та батька, а також від особливостей перебігу вагітності і пологів, і лише потім від умов навколишнього середовища, тобто всіх факторів, що формують фенотип.

У плода поетапно формуються окремі імунні функції в різні періоди його розвитку.

Гемопоез починається в жовтковому мішку між 3-м та 6-м тижня­ми внутрішньоутробного розвитку з проліферації плюрипотентних стовбурових клітин. Клітини, які здатні реалізовувати неспецифічні та специфічні імунні реакції, мігрують із загальної бази гемопоетичної системи, тобто, стовбурова клітина може мігрувати із жовткового мішка до загруднинної залози, кісткового мозку, печінки та селезінки. Таким чином відбувається поділ клітинних типів і становлення стабільних клітинних ліній, здатних до клональної проліферації. Утворюються лінії еритроцитів, гранулоцитів, моноцитів, мегакаріоцитів і лімфо­цитів. Лімфоїдні органи закладаються та розвиваються дещо пізніше за кровотворні. Далі спостерігають певну єдність в анатомії цих органів, їхньому розвитку та функціонуванні. Лімфоцити можна виявити в периферійній крові ембріона на 7—8-му тижні розвитку.

ПК-Клітини в плода з'являються на 9-му тижні гестації, однак їхня функція у внутрішньоугробний період недостатня для елімінації інфікованих вірусами клітин організму.

Т-Лімфоцити виявляють у тканинах плода приблизно на 6-му тижні гестації — спочатку в печінці та кістковому мозку, а згодом — у загруднинній залозі та селезінці. Кількість Т-лімфоцитів збільшується зі збільшенням терміну вагітності, але на момент народження їхня кількість менша, ніж у дітей у постнатальний період та в дорослих. Функціонально Т-лімфоцити плода також відрізняються: їх цито­токсична функція починає формуватися з 14-го тижня внутрішньоутробного розвитку. В цей час на тимоцитах плода виявляють АГ тканинної сумісності. Проліферативна активність Т-лімфоцитів у відповідь на мітогени (ФГА) досить висока і не відрізняється від показників у дорослих, тоді як цитотоксична активність Т-лімфоцитів-кілерів значно нижча, ніж у дорослих. Відомо також, що у внутрішньоутробний період, а потім у період народження та дитинства (грудний і переддошкільний вік) переважає супресорна спрямованість Т-системи. Супресорну функцію здійснюють не лише CD8⁺, але й інші, зокрема незрілі тимоцити, що циркулюють з маркерами СD1, СD10, СD11, а також ПК. Недостатньо повноцінна активність Т-системи імунітету плода зумовлює високу чутливість до таких протозойних та вірусних інфекцій, як краснуха, герпес, вірусний гепатит, токсоплазмоз, лістеріоз тощо.

Зрілі В-лімфоцити виявляють у крові плода на 12— 15-му тижні. Пізніше з'являється їхня здатність до утворення плазматичних клітин та продукції АТ. Кількість В-лімфоцитів у плода найбільша на 28-му тижні вагітності, в подальшому вона зменшується.

Синтез імуноглобулінів у плода починається із 17—20-го тижня внутрішньоутробного розвитку. Вміст ІgG у крові до 20-го тижня вагітності становить у середньому 0,1 г/л, до 32-го тижня підвищується до 0,4 г/л, а в новонароджених рівень власних ІgG — 1 г/л. Однак у доношених новонароджених високий рівень ІgG досягається не за рахунок синтезу власного IgG, а в результаті активного транспорту материнських ІgG крізь плаценту в останні тижні вагітності. Кількість імуноглобулінів у доношених дітей однакова з материнською. Трансплацентарне проникнення материнських ІgG забезпечує захист організму плода та дитини перших місяців життя від інфікування патогенними мікроорганізмами (переважно грампозитивними). ІgG₂ не проходить крізь плаценту, тому в новонароджених висока частота грамнегативної бактеріальної інфекції. Протягом 1-го півріччя життя діти не хворіють на вітряну віспу, кір та деякі інші вірусні інфекції.

ІgM крізь плаценту не проникає, що пояснює недостатню захищеність новонародженого від грамнегативних мікроорганізмів. При контакті з чужорідними АГ імунна система плода активує синтез ІgM. Підвищення рівня ІgМ у пуповинній крові понад 0,2 г/л свідчить про АГ-стимуляцію плода або його внутрішньоутробне інфікування. Позитивним моментом того, що ІgМ не проникає крізь плаценту, є відсутність тяжких наслідків для організму плода за несумісності з материнським за груповими еритроцитами АГ, оскільки до ІgМ належать і групові ізогемаглютиніни.

sIgA та ІgЕ також не надходять від матері. Рівень ІgА, що синтезується в організмі плода, дуже низький аж до самого народ­ження.

Фактори природного імунітету. Фактори природної резистентності філогенетично давніші і беруть на себе основну функцію захисту організму дітей перших днів і місяців життя до дозрівання більш досконалих імунних механізмів.

Вони виконують функцію першого бар'єру захисту організму. їхнє значення дуже велике у захисно-пристосувальних реакціях новонародженого.

З розвитком плода (12—18 тиж) активність фагоцитозу підвищується і до народження дитини досягає рівня показників дорослої людини. Однак якісно фагоцитоз у ново­народженого незрілий. Поглинальна здатність достатньо розвинута, а завершальна фаза фагоцитозу недосконала і формується до 6-місячного віку. Рівні катіонних білків, лізоциму, лактоферину, мієло-пероксидази, що беруть участь у завершальній стадії фагоцитозу, знижені і лише потім підвищуються. У дітей перших місяців життя не піддаються фагоцитозу Pneumococcus, Klebsiella, Haemophilus influenzae, а стафілококи та гонококи навіть зберігають здатність розмножуватись у цитоплазмі фагоцитів.

До центральних органів імунної системи належать кістковий мозок і загруднинна залоза, у яких зі стовбурових гемопоетичних клітин диференціюються лимфоцити (етап антиген-незалежного диференціювання). Центральні органи імунної системи розміщені в добре захищених від зовнішнього впливу місцях: кістковий мозок — у кістковомозковій порожнині, загруднинна залоза — у грудній порожнині за широкою та міцною грудниною. У центральних органах імунної системи лімфоїдна тканина пере­буває в своєрідному мікрооточенні. У кістковому мозку таким мікрооточенням є мієлоїдна, в загруднинній залозі — епітеліальна тканина, що розвивається з ембріональної епітеліальної закладки 3-ї та 4-ї зябрових кишень.

Кістковий мозок закладається на 4—5-му тижні внутрішньо-утробного розвитку, а починає свою функціональну активність на 11—12-му тижні. Він є постачальником самопідтримувальної популяції поліпотентних стовбурових клітин для двох ростків крово­творення — лімфо- і мієлопоезу, з яких надалі розвиваються Т- і В-лімфоцити, моноцити, гранулоцити, еритроцити, тромбоцити та макрофаги тканин. Саме в кістковому мозку відбувається дозрівання В-клітин у В-лімфоцити, що несуть поверхневі імуноглобуліни.

Загруднинна залоза (thymus). В ембріогенезі закладка загруднинної залози має вигляд епітеліальних бруньок і є випинанням, що зберігає зв'язок із зябровою кишенею через ductus thymopharyngeus. Після цього ліва і права закладки залози швидко збільшуються в розмірі і разом із зародками щитоподібної і прищитоподібних залоз і телебрахіальними тільцями утворюють так званий брахіальний комплекс. Загруднинна залоза, як і інші бранхіогенні органи, розвивається із передньої кишки і як орган імунної системи закладається й розвивається раніше за інші (на 4—5-му тижні внутрішньоутробного періоду) та чинить вирішальний вплив на становлення, структуру і функцію її периферійних органів. У зародка на 10-му тижні розрізняють кіркову та мозкову речовину, у петлях сітки виявляють круглясті вільні клітини. До 20-го тижня внутрішньоутробного періоду відзначається щільна інфільтрація залози як лімфобластами, так і середніми та малими лімфоцитами. Рясна васкуляризація залози починається кінця 4-го місяця, коли вглиб закладки вростають вузькі тонкостінні судини, що густо розгалужуються й утворюють переплетення в мозковій речовині.

Лімфоїдні клітини загруднинної залози (тимоцити) з'являються водночас з утворенням сітчастої основи органа. Кількість їх дуже швидко збільшується на початку 3-го ембріонального місяця. Низкою властивостей лімфоїдні клітини загруднинної залози відрізняються від звичайних лімфоцитів, вони дещо менші за лімфоцити лімфатичних вузлів. Існують різні точки зору щодо джерела тимоцитів, однак найбільш імовірним є уявлення про заселення органа мігруючими ззовні стовбуровими клітинами.

У новонародженого загруднинна залоза добре розвинута, чітко видно поділ на кіркову і мозкову частини з домінуванням першої. Надалі зона кіркової речовини звужується, а мозкової розширюється. Тут дозрівають дві категорії Т-лімфоцитів — імунологічно незрілі в кірковій та імунологічно активні в мозковій речовині. У ній виявляють тільця Гассаля, у центральних відділах яких з трирічного віку формується гіаліноз.

Ознаки вікової інволюції з'являються вже в дітей десятирічного віку (зменшення кількості лімфоцитів у залозі з редукцією кіркової речовини, зменшення кількості тілець Гассаля, збільшення кількості жирових клітин, поява сполучної тканини).

У формуванні імунної системи, її структури і функції провідну роль відіграє загруднинна залоза. Доведено, що її вилучення у новонароджених тварин суттєво впливає на стан інших лімфоїдних органів: у селезінці триває еритро- і мієлопоез, але утворення лімфоїдних фолікулів гальмується, лімфатичні вузли атрофуються, лімфатичні елементи в них заміщуються ретикулоендотеліальними та плазматичними клітинами. В периферійній крові — лімфопенія. Здатність до імунних реакцій різного типу різко знижується. Тимектомія в більш пізні періоди жидтя не призводить до таких тяжких наслідків. Це дозволяє вважати, що загруднинна залоза є центральним органом імунної системи, що і визначає хід її розвитку та функціонування, особливо у фазу ембріогенезу та наступного антенатального розвитку, а також у період новонародження. Відносні розміри залози, продукція тимічних гормонів максимальна в антенатальний період та на момент народження, тоді як формування лімфатичних вузлів та селезінки — в постнатальний період.