13. Молекулярные базы данных. Специализация, структура и методы поиска информации

Молекулярная база данных – это коллекция данных, которые

• Упорядочены

• Аннотированы

• Индексированы

• Регулярно обновляются

• Имеют перекрёстные ссылки

А также это специализированное ПО для поиска и изменения информации.

Потребность:

• Взрывообразный рост объёма информации

• Многие экспериментальные данные больше не публикуются в литературе и присутствуют только в базах данных

• Базы данных позволяют использовать мощные инструменты в биологических исследованиях

Виды баз данных:

• Нуклеотидные(EMBL/GenBank/DDBJ)

• Белковые

1. Аннотированные последовательности(Swiss-prot/PIR)

2. Трёхмерные структуры(PDB)

GenBank – основная нуклеотидная база данных.

Создана в 1979г. в LANL (Los Alamos США)

С 1992 в ведении NCBI

Размер на февраль 2010г.

112 млн нуклеотидов

165,5 млн. последовательностей

SWISS-PROT – наиболее информативная белковая база данных.

Создана в 1986г. В Женеве

Практически нет дупликаций

Перекрёстные ссылки на 55 других баз данных

Качественная аннотация

Ошибки в базах данных:

1. Ошибки аннотаций

2. Ошибки секвенирования

Для поиска в базах данных используют программы FASTA и BLAST.

Программы имеют эвристический подход: программы пытаются найти не оптимальное, а достаточно хорошее решение.

Принцип действия алгоритмов:

• Найти короткие совпадающие последовательности без пробелов длиной 1-2 или 3 буквы

• Расширить эти слова в обе стороны насколько возможно, посчитывая очки

• Попробовать состыковать соседние расширенные сегменты

• Пересчитать очки в статические оценки вероятностей совпадения последовательностей

• Сделать глобальное совмещение для наиболее достоверно совпавших последовательностей.

14. Функциональная геномика. Подходы к идентификации генов в геномных последовательностях и определение их функций

Есть несколько экспериментальных методик, связанных с полной или частичной идентификацией гена.

Самый старый и самый простой способ – это гибридизация. Если у нас есть какой-то изученный геном и его гены известны, можно сделать зонды под эти гены, гибридизовать их с ДНК исследуемого организма и таким образом увидеть, где локализуется ген в геноме. Различные модификации такой методики (либо FISH, либо люминесцентное микроскопирование) позволяют разобраться, где какой ген расположен при условии наличия достаточно подробной физической карты. Недостаток: должны быть зонды под каждый ген, прицельные, т.е. их нужно готовить специально.

Вариант гибридизации, так называемый зоо-блоттинг, не предусматривает приготовления отдельных зондов под каждый из генов. Здесь метится сразу вся ДНК. Идея: за счет того, что более консервативна кодирующая последовательность, чем некодирующая, гибридизоваться будут именно гены. Межгенные участки гибридизоваться не будут. Особой проблемой является идентификация концов рамок считывания. Есть несколько методик, которые позволяют находить концы. Наиболее часто используемой является RACE-методика. Общая суть: к известной части мРНК делается праймер и с него начинается обратная транскрипция в сторону начала гена. Затем либо идет секвенирование, либо, что гораздо чаще, это все амплифицируется, а потом уже идет идентификация размеров ПЦР-продукта, а может быть, и секвенирование. С секвенированием – самый надежный вариант. Если просто делать кДНК на мРНК в качестве матрицы, то при секвенировании кДНК концы теряются. Тогда ближе к концу к последовательности известного сиквенса делается праймер, который будет читаться в сторону начала, будет синтезироваться кДНК уже с этого праймера. Реакция скорее всего пройдется там, где ген стартует.

Есть также методики добавления праймера к концу. Обычно подшивается олигонуклеотид. Другая методика, которая также позволяет найти концы транскрипта, – S1-картирование. S1-нуклеаза специфична к одноцепочечным участкам ДНК. Все методики, связанные с S1-картированием, основаны на том, что одноцепочечный участок будет деградироваться, а двухцепочечный – не будет. Здесь исследуемый фрагмент нужно клонировать в векторе, который позволяет синтезировать одноцепочечную ДНК. Затем с этой одноцепочечной ДНК гибридизуется мРНК, такой гибрид обрабатывается нуклеазой, и получается двунитевой фрагмент. Этот фрагмент можно с одной стороны обрезать фиксированной рестриктазой и, таким образом, получить один фиксированный конец. Тогда можно определить, где второй конец, просто по размеру продукта. В некоторых случаях проблема заключается в том, что даже внутренние экзоны могут потеряться, если они короткие, или не очень консервативные, или не находится гомология, или кодонные предпочтения не очень ярко выражены. Есть специальные методики, которые позволяют прицельно охотиться за экзонами при помощи векторов – так называемых ловушек для экзонов. Это вектор для клонирования, в котором сайт для клонирования расположен между двумя экзонами. Располагается промотор, затем последовательность ДНК, которая соответствует экзону, интронная последовательность (сайт для клонирования) и еще один экзон. Если инициировать транскрипцию с промотора вектора, будет синтезироваться РНК, затем подвергаться процессингу. В результате получится мРНК с двумя этими экзонами. На ней можно синтезировать кДНК, прогнать с ней ПЦР и посмотреть, какой размер получится. Если клонировать произвольные фрагменты ДНК по рестрикционному сайту, возможны две альтернативные ситуации: есть экзон, нет экзона. Если экзона нет, то, какого бы ни была размера вставка, после сплайсинга все равно будет получаться продукт исходного размера. Если экзон попался, процессированная РНК будет больше. Это нужно детектировать путем сначала обратной транскрипции, затем ПЦР. Таким образом можно находить фрагменты ДНК, которые несут экзоны. А затем уже секвенирование этого куска покажет, где этот экзон находится.