Характеристика возбудителя

Морфология и химический состав. Установлен генетический плеоморфизм гена нуклеопротеида Б. Все 69 изолятов ВБ из различных частей мира принадлежат к серотипу 1, причем идентифицировано по крайнем мере 12 филогенетических линий в соответствии с географической локализацией хозяина. Селекция, возможно, связана со специфичностью хозяина, ограничивает изменения аминокислотных последовательностей и АГ дрейф.

Устойчивость. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 23°С инактивирует его через 28-53 дня, 50°С - через 1 ч, 60°С - за 5-10 мин, 70°С - мгновенно. Высушивание инактивирует вирус в течение 10-14 дн. В гниющем материале он гибнет через 15 дн. УФ лучи убивают за 5-10 мин. Дезинфицирующие в-ва (р-ры формальде­гида, гидроксида натрия, хлорной извести) действуют на ВБ губительно. Вирус устойчив к рН 5-10 при 4°С.

Антигенная структура. Нуклеокапсид ВБ представляет собой спиральные тела, со­стоящие из белков N, NS и L, составляющих 96% его массы, белок N-вирионной РНК, за­щищающей ее от действия РНК-азы; высокомолекулярный белок L и небольшой белок NS не связаны с нуклеокапсидом и содержатся в вирионе в незначительном количестве. Внут­ренним белком вирусной оболочки является негликозилированный мембранный или матриксный (М) белок. Кроме белка М у ВБ в состав внутреннего слоя оболочки входит белок А или клеточный актин с мол.м. 43 кД, содержание которого достигает 1-5% массы вирионных белков. До недавнего времени считалось, что все штаммы ВБ имеют одинаковый АГ состав. Однако с помощью монАТ удается легко различать фиксированные и дикие его штаммы как по нуклеокапсидн.ым, так и по гликопротеиновым АГ. В вирионах ВБ обнару­жено 5 белков. Гликопротеин G способен индуцировать образование ВНА и защищать животных от заражения. Нуклеокапсидный АГ индуцирует образование КСА и ПА.

Антигенная вариабельность и родство. Ранее все штаммы ВБ рассматривались как единые в АГ отношении. Однако благодаря гибридомной технологии появилась возмож­ность получения монАТ к отдельной АГ детерминанте. МонАТ позволили выявить тонкие АГ связи и различия между штаммами вирусов группы Б. В настоящее время считают, что вирус Б имеет 4 серотипа, что, видимо, обусловлено различием в составе мембранных бел­ков. Учитывая это, была предложена следующая классификация вируса: вирус 1-го сероти­па; прототип этого вируса - шт. CVS и сходные с ним полевые и лабораторные штаммы, выделенные в различных частях света; вирус 2-го серотипа; прототип его - шт. Lagos Bat, выделенный из костного мозга летучей мыши в Нигерии; вирус 3-го серотипа; прототип его - шт. Мокола, выделенный от землеройки и человека; вирус 4-го серотипа - шт. Obodhiang, выделен от лошадей, комаров и москитов в Нигерии и еще не классифицирован. Все варианты ВБ в иммунобиологическом отношении родственны. Нуклеопротеидные АГ различных ВБ имеют группоспецифическое родство с другими рабдовирусами. Мо­нАТ к различным штаммам ВБ открыли новую страницу в изучении тонкой АГ структуры лиссавирусов, представили дополнительные возможности для решения теоретических и прикладных задач рабиологии. Показана перекрестная защита мышей против широкого спектра изолятов ВБ. Любой штамм ВБ или его гликопротеин могут быть использованы для вакцинации во всем мире.

Локализация и выделение вируса. Многочисленные исследования патогенеза Б позволили условно разделить острую рабическую инфекцию на III основных фазы: I - экстраневральная фаза, без видимого размножения вируса в месте инокуляции, II - интраневральное, центростремительное распространение инфекции и III - диссеминация вируса по всему организму, сопровождаемая появлением симптомов болезни и, как правило, гибелью животного. Распространение ВБ по нервным путям впервые доказано Пастером и Ру. Вирус проникает в организм со слюной в местах укуса и непродолжительное время сохраня­ется в месте внедрения (до 2-х нед.), а затем по центростремительным нервам продвигается к спинному и головному мозгу. Из мозга по центробежным нервам он попада­ет в слюнные железы, где репродуцируется в нервных узлах и после дегенерации нервных клеток выходит в протоки желез, инфицируя слюну. Из мозга вирус также нейрогенным пу­тем попадает в слюну, роговицу, надпочечники. Выделение вируса по слюной начинается за 10 дн. до проявления клинических признаков, поэтому французский регламент предусматри­вает 15-дн. срок наблюдения за покусавшим животным. У бешенной лисицы накапливается в слюнных железах столько вируса, что можно заразить 67 млн. лисиц. Доказано нахожде­ние вируса во всех внутренних органах и крови, кроме сальника, селезенки и желчного пу­зыря. Из ЦНС по нервным путям вирус попадает во внутренние органы, а затем в кровь. Та­ким образом происходит стадия генерализации инфекционного процесса.

Персистенция вируса. За последние годы описаны казуистические случаи неоднократ­ного выделения ВБ из слюны здоровых собак на протяжении почти 2-х лет после их инфицирования. Аналогичная картина наблюдалась и у некоторых экспериментально заражен­ных кошек. В 1981 г представлены результаты 4-летного изучения Б мангустов, выловлен­ных в ряде районов Гренады. С помощью ИФ ВБ обнаружен в срезах мозга 100 (2,1%) из 4754 обследованных мангустов. Среди 1675 обследованных животных обнаружены ВНА в пробах 498 сывороток (30%). При сопоставлении результатов обнаружения Б и соответст­вующих AT обнаружено, что число больных животных в течение 1971-1974 гг. ежегодно снижалось (с 3,5 до 0,6%), количество мангустов с определяемыми AT увеличилось с 20,8 до 43,2%. AT к Б, как отмечено, в опытах с отловленными в природе мангустами (20 осо­бей), циркулировали в крови еще 35 мес. У животных с наиболее высокими титрами AT (1 : 1400) отмечена и наибольшая скорость их снижения.

Одно из свойств ВБ - способность к персистенции in vivo и in vitro Хроническая инфек­ция клеток Нер-2/2 и ВНК-21/13 фиксированным ВБ сопровождается определенными изме­нениями клеточного метаболизма. АГ ВБ образуется в цитоплазме клеток независимо от включений. Персистенцию ВБ удается наблюдать при хронической инфекции в клеточных культурах, причем по морфологии и скорости размножения клеток хронически инфициро­ванные культуры не отличались от незараженных. Вирусный АГ передавался при делении клеток. После того, как была показана возможность образования дефектных интерфери­рующих частиц (ДИЧ) ВБ при первичной инфекции in vivo, ДИЧ были выделены и охарак­теризованы при хронической инфекции ВБ клеток ВНК. Генерация ДИЧ в нейронах ЦНС может не только определять окончательный исход инфекции, но и объяснять ее латентный характер. В настоящее время данные о роли интерферона и ДИЧ в механизме хронической инфекции ВБ в клеточных культурах противоречивы.

Антигенная активность. Животные, иммунизированные против Б, продуцируют ВНА, КСА, ПА, анти-ГА и литические (разрушающие клетки, зараженные вирусом в присутствии комплемента) AT. Поверхностный гликопротеин G оболочки ВБ - единственный белок, от­вечающий за индукцию ВНА и формирование протективного иммунитета, защищая лабора­торных животных от латентной инфекции. В отличие от цельных вирионов субвирус­ный препарат не обладает ГА активностью. Нуклеокапсидн.ый АГ вызывает образова­ние КСА и ПА. Он является группоспецифическим АГ для всех лиссавирусов. Препараты очищенного нуклеокапсида из клеток ВНК-21, зараженных шт. FLURI-HEP и ERA, индуци­руют только КСА. Иммунные AT сыворотки крови в присутствии комплемента лизируют зараженные культуры клеток. Между титрами КСА и ВНА никакой корреляции не обнару­жено. Эти AT появляются независимо друг от друга и индуцируются, по-видимому, разны­ми АГ. Накопление КСА характеризует ответ на вакцинацию, но этому не обязательно со­путствует накопление ВНА.

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на теплокровных всех видов, однако в условиях лаборатории - чаще всего на мышах и сравнительно редко (требуются особые условия) на собаках. Показана различная чувствительность мышей к эксперимен­тальному Б в зависимости от патогенных свойств вируса, пола, возраста и способа инфицирования. Показано, что патогенность v.fixe Б для взрослых мышей зависит от АГ детерми­нант поверхностных гликопротеинов вируса. Изменение патогенности коррелирует с заме­щением аргинина в позиции 333 молекулы гликопротеина другой аминокислотой. Последнее время появились сообщения о возможности выздоровления больных Б животных в есте­ственных и экспериментальных условиях.

Культивирование. Помимо интрацеребральных пассажей на кроликах и белых мышах ВБ (шт. Fluri-HEP и Lep) успешно репродуцируется в культуре фибробластов КЭ. Показана высокая чувствительность к ВБ (шт ТС-80 и CVS) и высокий уровень накопления АГ в зараженных перевиваемых культурах - почки сайгака (ПС) и почки эм­бриона африканской козы (ПЭАК). Показана также возможность культиви­рования ВБ в культурах клеток слюнной железы и почки собаки, жировой ткани летучей мыши, почек поросенка, кролика, сирийского хомяка, эмбрионов овцы, человека и японских перепелок. ВБ адаптирован и к перевиваемым линиям клеток (ВНК-21/13, эндотелия кроли­ка, диплоидной линии клеток легких эмбриона человека - HDC S, известной под названием Wi-38) Показана возможность его репродукции в перевиваемых линиях клеток пойкилотермных позвоночных, в частности, в клетках рыбы, змеи, черепахи и ящерицы Наиболее перспективна перевиваемая линия клеток ВНК-21/13, использование которой позволяет накапливать вирус в больших количествах. Не все штаммы с одинаковой легкостью поддают­ся адаптации к культуре клеток. При адаптации ВБ к культурам клеток прибегают к различ­ным приемам. Интенсивность размножения вируса в культуре клеток можно постоянно кон­тролировать методом ИФ. К ВБ после предварительной адаптации восприимчивы и КЭ. Для культивирования штаммов уличного ВБ обычно используют КЭ.

ГА свойства. Обусловлены наличием у вируса ГА АГ, находящегося на поверхности вириона в выступах его оболочки. Было показано, что выращенный в культуре клеток и концентрированный ВБ вызывает феномен гемагглютинации. Между инфекционной и ГА активностью существует линейная зависимость, поэтому титрование вируса по инфекционности может быть заменено тестом определения ГА активности.

ГАд свойства. Впервые гемадсорбирующие свойства ВБ (шт. Мочалин), выращенного в культуре первичных клеток почки сирийского хомячка, описаны в 1967 г. Феномен вос­производился с эритроцитами гуся, курицы, сирийского хомячка, морской свинки и обезья­ны при температуре 4°С. Специфичность реакции была подтверждена с помощью иммунной сыворотки; после 3-4-кратного отмывания гемадсорбция не разрушалась и не воспроизво­дилась с другими штаммами ВБ.

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источник и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные животные. Для штаммов ВБ, поддерживаемых в организме собак и волков, характерна высокая тропность к ЦНС и низкая к висцеральньм органам, поэтому вирус, выделяемый со слюной, может от­сутствовать в крови, моче, молоке больного животного. Естественное распространение Б среди собак почти полностью зависит от классической цепи передачи укус - рана. Почти все случаи передачи Б собак и волков человеку и сельскохозяйственным животным также объ­ясняются попаданием вируссодержащей слюны в раны, нанесенные при укусах, однако воз­можно заражение при ослюнении пораженной кожи. Алиментарный и аэрогенный пути за­ражения в принципе возможны, но они не играют существенной роли. Доказана возмож­ность трансплацентарной передачи вируса в естественных условиях путем выявления вируса в органах плода КРС В настоящее время доказана роль летучих мышей различных видов в распространении ВБ Лисицы (Vulpes vulpes) являются вектором Б в Европе и Северной Америке, обусловливая 60-85% заболевания. Необычная их роль в современной эпизоото­логии Б объясняется непомерным увеличением популяции, чрезвычайной восприимчиво­стью к ВБ, а также возможностью перорального заражения.

Спектр патогенности в естественных условиях. Очень широк. Эпизоотические штаммы ВБ различают по вирулентности и другим свойствам. Описанные варианты разде­ляют на 5 групп. К 1-ой группе относятся так называемые усиленные штаммы (или вирусы ремфорс), характеризующиеся высокой вирулентностью, коротким инкубационным перио­дом болезни (1-2 дня) и постоянным образованием телец Бабеша - Негри. Во 2-ю группу входят следующие варианты: а) вирус, выделенный от собак (Улу-Фато). Подобные ему штаммы встречаются в различных районах Африки. Характерный признак - внезапное из­менение поведения и развитие параличей; б) вирус, выделенный от больного КРС в Кадейросе. Клинически болезнь напоминала чуму, но затем развились параличи. Установлено, что этот вирус передается летучими мышами; в) вирус, выделенный от погибших людей во время эпидемии Б на острове Троица в 1929 г. Одновременно болели и КРС, лошади, мулы, ослы Возбудитель передавался через укусы летучих мышей-вампиров. К 3-й группе отнесе­ны штаммы, выделенные от песцов и собак при заболевании, именуемом ликованием, встречающемся в северных районах России и Канады. Симптомы дикования несколько от­личаются от течения истинного Б. Почти никогда не болеет человек. В 4-ю группу включен вирус, выделенный в США в 1940 г. Личем и Джонсоном из мозга умершей девочки по имени Флури (шт. Флури, неадаптированный). Вирус вызывает у собак, кошек, морских свинок, мышей болезнь, проявляющуюся параличами. Болезнь очень сходна с заболевани­ем, вызываемым фиксированным вирусом. Кролики малочувствительны. В мозге больных животных данный штамм не индуцирует образования телец Бабеша – Негри. В 5-ю группу объединены вирусы, выделенные от людей. Сюда отнесен вирус, изолированный в 1929 г. Корчнером, вирус Кобояси и герпесподобный вирус ДК. От диких грызунов выделено много полевых штаммов, подобных ВБ и родственных с ним в АГ-отношении. В 1967 г в Сури­наме (Южная Америка) из мозга павших телят, зараженных в естественных условиях, изо­лированы 2 полевых штамма Б (Д-292 и Д-298), подобных штамму-фикс Пастера. Следует отметить, что если Б - в основном летальная инфекция, то при инфицированности вирусами Мокола, Лагос Бат, Ободьянг и Котонкан случаи гибели при экспериментальном заражении относительно редки. Вирусы Котонкан и Ободьянг патогенны только при интрацеребральном заражении мышей-сосунов и патогенны для собак и обезьян при заражении в мозг или внутримышечно. Вирусы Лагос Бат и Мокола апатогенны для мышей при экстраневральном заражении и не вызывают образования телец Бабеша – Негри. Вирус острого энцефалита человека формировал включения в нейронах мозга животных и эктодермальных клетках ХАО зараженных КЭ, но они отличались по структуре от телец Бабеша - Негри имели отчетливую 1-слойную оболочку, представляли собой РНК-содержащие плотные об­разования размером 2-4 мкм и выявлялись как в цитоплазме, так и в ядре клеток. Однозначных представлений о рецепторах, обусловливающих проникновение ВБ в ЦНС, не су­ществует. Предполагается роль ацетилхолиновых рецепторов, холинэргических рецепторов мускаринового типа, а также проникновение через тройничные и другие нити. Авирулентные варианты теряют способность проникать в парасимпатические нервные нити, но сохра­няют способность к пенетрации в волокна тройничного нерва.

Спектр патогенности ВБ тесно связан с его экологией, которая имеет свои особенности. Так, имеются 2 формы эпизоотиии Б: городская и лесная. При 2-й форме возбудитель цир­кулирует среди диких плотоядных по типу природно-очаговой инфекции. С 60-х гг. Б диких плотоядных снова стало преобладающим. Основным резервуаром и источником инфекции оказались рыжие лисицы, тогда как остальные дикие животные играют второстепенную роль. Чрезмерному увеличению численности лисиц способствовало истребление их естест­венных врагов - волков, рысей, медведей, орлов и других хищников. Установлено, что средняя плотность популяции лисиц 5 голов и более на 250 га обеспечивает высокий уровень поддержания и распространения эпизоотии Б среди лисиц появляется прежде всего на тер­риториях с массовым распространением грызунов - основного источника корма для них КРС заражается исключительно на пастбищах, входящих в ареалы зараженных лисиц.

При лесном Б большое количество лисиц (40-80%) переживает инфекцию за счет "нелетального" Б. Болезнь у них часто протекает хронически и латентно, обеспечивая персистенцию вируса в естественных условиях. Наоборот, Б собак в городских эпизоотиях, как правило, заканчивается их гибелью, поэтому механизм поддержания вируса иной, он сво­дится к коротким циклам репродукции в организме и быстрой передаче восприимчивому организму.

Клинические признаки и патологоанатомические изменения. У собак инкубацион­ный период варьирует от нескольких недель до года, в среднем 2-8 нед. Его продолжитель­ность зависит от вида, возраста, резистентности животного, количества проникшего вируса и его вирулентности, места локализации и характера раны. Чем богаче нервными оконча­ниями ткань в месте внедрения вируса, чем глубже рана и больше она ослюнена, тем короче инкубационный период. У 70% заболевших домашних животных клинические признаки Б начинают проявляться между 15-60 дн. после заражения, а у остальных - раньше или позже.

В развитии болезни различают 3 стадии: продромальную, возбуждения и пара­личей.

Продромальная стадия (стадия предвестников) характеризуется повышением чувст­вительности животных к шуму, свету, прикосновениям, извращением аппетита, нарушением зрения, повышением температуры тела. Эта стадия длится от 12 ч до 3-х сут. Стадии возбу­ждения свойственны приступы буйства, ярости, расстройства чувствительности и сознания, оглумообразное состояние. Наблюдаются судороги, парезы жевательных мышц и мышц глотки, сужение зрачков, учащенные позывы к мочеиспусканию Лихорадка достигает мак­симума. В стадию параличей снижается и даже исчезает болевая чувствительность. Наруша­ется деятельность центров кровообращения и дыхания. Температура тела понижается. Тече­ние болезни заканчивается летально. Однако при серологическом исследовании диких жи­вотных, собак, кошек и вампиров в сыворотке крови обнаруживают ВНА, что, вероятно явилось результатом бессимптомного переболевания. Течение Б за последние годы претерпело существенные изменения и проявляется без стадий свойственных классической болезни В последние годы стали преобладать парали­тическое и атипичное проявления болезни. У КРС инкубационный период продолжается от 2 нед. до нескольких мес., чаще 3-6 нед. Клинические признаки в начале болезни неспецифичны: потеря аппетита, замедленная моторика рубца, иногда дрожание, затем паралич глотки и связанный с этим отказ от корма, обильное слюнотечение. Стадия возбуждения может отсутствовать. Она лучше выражена у животных выпасного содержания по сравнению с животными стойлового содержания.

Для буйной формы характерны возбуждение животного, затрудненное жевание и глотание, прекращение лактации. Затем возбуждение переходит в буйство, животное стремится сорваться с привязи, хрипло мычит, бросается на препятствия, оглядывается на живот, падает на землю. Наблюдаются обильное слезотечение и потоотделение, фибриллярное подрагивание отдельных групп мышц. Зрачки расширены, конъюнктива гиперемирована, иногда возникает зуд на месте укуса и половое возбуждение. Жвачка становится вялой или совсем прекращается, часто повторяются позывы к мочеиспусканию и дефекации. Развиваются параличи нижней челюсти, языка, мышц конечностей Смерть наступает на 3-6-й день.

Паралитическая стадия Б у КРС встречается наиболее часто. Начало болезни характеризуется снижением молочной продуктивности и аппетита. Наблюдается хриплое мычание, животное отстает от стада. Развиваются атония преджелудков, слюнотечение, затрудненное дыхание, глотание, животное подолгу пережевывает корм, но не проглатывает его. Teмпература тела повышается до 40-41°С. Наблюдаются фибриллярное подергивание мышц, повышение потоотделения, признаки нарушения координации движения, запрокидывание головы. У некоторых животных в период вышеперечисленных признаков появляется возбуждение (в том числе половое, хриплое мычание). Смерть наступает на 3-6-й день. В 1990-1991 гг. в Аргентине наблюдалась эпизоотия паралитического Б среди КРС и людей. В это время отмечались случаи гибели рукокрылых, гематофагов и от них выделяли ВБ.

У собак Б проявляется в буйной или тихой форме. При буйном Б различают 3 стадии: продромальная характеризуется угнетением и длится до 3-х сут Животное угнетено, прячется в темные углы В иных случаях собака ласкова. К концу стадии животное лает на предметы, извращается аппетит. Иногда на месте укуса возникает сильный зуд, животное вылизывает, расчесывает, грызет это место. Затрудняется глотание, появляется слюнотечение, хриплый лай. Животное бросается на человека, других животных, что свидетельствует о стадии возбуждения, которая продолжается 3-4 дня. Затем наступает стадия параличей, продолжающаяся 1-4 дня. Болезнь длится 8-11 дн.

Тихая форма часто проявляется у собак, покусанных инфицированными лисицами. Первые признаки болезни - затрудненное глотание, слюнотечение, затем параличи нижней челюсти, конечностей, туловища. Гибель наступает через 2-4 дня.

У овец, свиней, лошадей болезнь проявляется также в двух формах: буйной и паралитической). Лисицы при заболевании настораживают необычным поведением, теряют чувство страха, нападают на собак, коров и людей. Больные животные быстро худеют, часто возникает зуд в области инфицирования. Возможны вялость, паралич, гидрофобии не наблюдается. Считают, что суслики являются естественным резервуаром ВБ и могут служить моделью для изучения его персистенции.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. Обычно при вскрытии отмечают истощение, шерсть головы и шеи смочена слюной. В желудке иногда обнаруживают инородные предметы. У жвачных в сетке и книжке находят сухие, плотные кормовые массы. Часто тонкий кишечник воспален, с кровоизлияниями.

Патогенез. Рецепторами ВБ на мембранах нейронов служат полисиалогликозиды. Проводимость импульсов на синаптических мембранах зависит от взаимодействия отрицательно заряженной сиаловой кислоты тиогликозида и ионов Са²⁺ . Препараты гликопротеинов выделяли из отдельных частей головного мозга здоровых и экспериментально инфицированных ВБ лисиц. В препаратах определяли отсутствие полисиалогликозидов и концентрацию сиаловой кислоты, ионов кальция, белка. Во всех проверенных частях мозга заразных лисиц обнаружено повышенное содержание сиаловой кислоты, причем в препаратах коры головного мозга и аммонова рога в 20 раз превышала контрольные значения. Это непосредственно приводит к увеличению отрицательного заряда на синоптических мембранах и к более высокой проницаемости этих мембран. Известно о трех путях проникновения вируса от глаз до мозга: по окуломоторному па­расимпатическому нерву; перкорнеальный путь заражения; путь по зрительному нерву.

Механизм, посредством которого вирус достигает ЦНС, изучался рядом исследователей. При прогрессировании Б на хомячках было показано, что начало продвижения вируса свя­зано с сокращением мышечных клеток около места инокуляции с инфицированном миоцитов и последующим выходом вируса в экстрацеллюлярное пространство. ВБ может распро­страняться в ЦНС также за счет цереброспинальной жидкости.