Предварительная подготовка срезов к окрашиванию

Перед тем, как приступать к окрашиванию срезов, их, как правило, подвергают предварительной обработке, характер которой зависит от методов фиксации, уплотнения материала и приготовления срезов.Парафиновые срезы требуют наиболее сложной подготовки. Так как парафин не обладает достаточной прозрачностью и затрудняет процесс окрашивания (гистологические красители – это водные или спиртовые растворы, плохо проникающие в парафинированные ткани), его необходимо удалять из среза. Для этого срез подвергают депарафинированию – процессу, обратному тому, который осуществляют при подготовке объекта к заливке в парафин, т.е. срезы последовательно проводят через растворитель парафина, спирты нисходящей концентрации и помещают в воду. Практически это осуществляют так. Этикетируют бюксы, наливают в них соответствующие растворы и устанавливают в определенной последовательности:

Ксилол (бензол, толуол)	две смены	по 2-4 мин.
Спирт 96%	две смены	по 2-3 мин.
Спирт 70%		2-3 мин.
Вода дистиллированная	две смены	по 2 мин. и больше.

Можно одну смену 96% спирта заменить порцией абсолютного спирта, а вместо 70% применить 80% или 60% спирт. Важно сохранять лишь принципиальную схему.Для ускорения растворения парафина предметные стёкла покачивают или подогревают ксилол.После удаления парафина и проведения через спирты нисходящей концентрации стёкла со срезами быстро переносят в воду, погружая сразу на дно чашки с водой.В воде срезы оставляют на 1-2 минуты, т.е. до тех пор, пока они хорошо отмоются. Преждевременное извлечение препарата из воды, когда спирт ещё может оставаться в срезе, сопряжено с таким же риском, как и только что отмеченное медленное погружение в воду. При хорошем удалении парафина и ксилола вокруг среза в воде не должно образоваться никакой мути, в противном случае его нужно ещё раз обработать спиртом, так как образовавшая эмульсия будет препятствовать окрашиванию.Целлоидиновые среды можно окрашивать без предварительного удаления целлоидина, помещая пред крашением в дистиллированную воду. Если краситель окрашивает целлоидин, то последний удаляют в смеси абсолютного спирта с эфиром (1:1), после чего обрабатывают так же, как при депарафинировании (спирты нисходящей концентрации - вода).Желатиновые срезы освобождают от желатина (т.к. он окрашивается красителями), помещая в слегка подкисленную дистиллированную воду, подогретую до 37⁰С. Если блок хранился в формалине, то удалить желатин невозможно, и это может затруднить микроскопирование.Замороженные срезы не нуждаются в предварительной обработке, т.к. обычно при резке их собирают в дистиллированную воду.

Обзорные методы окрашивания

Для обзорных целей в гистологической практике чаще всего употребляют гематоксилин – эозиновую окраску. Этот метод отлично выявляет все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры, поэтому применяется практически во всех случаях, независимо от поставленной цели.К обзорным (общим) методам окрашивания также относится: окраска железным гематоксилином по методу Гейденгайна и окраска соком черники или аронии.Окраска гематоксилин - эозином является двойной: гематоксилин – основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин – кислый краситель – красит цитоплазму клеток и в меньшей степени – различные неклеточные структуры.Гематоксилин Имеет вид буроватого кристаллического порошка, хорошо растворимого в спирте, глицерине и плохо в воде.Красящим веществом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления – гематеин. дает окрашивание только при применении протрав, с которыми он образует солеобразные соединения - лаки.Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Одним из лучших и наиболее распространенных является квасцовый гематоксилин Эрлиха, который окрашивает ядра в синий цвет. Для его приготовления 2 г. гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют в 100 мл. дистиллированной воды, 100 мл. глицерина, 3г. калийных квасцов 10 мл. ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Калийные квасцы должны быть химически чистыми. Полученный раствор наливают в широкогорлую банку, завязывают марлей и в таком виде выдерживают на свету при доступе воздуха в течение 15 дней и более. В начале красящий раствор имеет светло-коричневый цвет, а по мере созревания становится темно-вишневым и приобретает приятный запах; при этом краска значительно усыхает. Для ускорения созревания раствор время от времени взбалтывают. Созревший раствор может долго храниться в банках с притертыми пробками.Эозин – искусственный цитоплазматический краситель, растворимый в воде и спиртах.Окрашивает цитоплазму клеток в розовый цвет, который хорошо контрастирует с синей окраской ядер гематоксилином Эрлиха.Для приготовления эозина 0,1г красителя растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Можно использовать и 0,25 – 05% спиртовые растворы эозина, для приготовления которых берут спирты различной крепости (40 до 70⁰); они окрашивают сильнее водных. Если ткани плохо воспринимают обычный (не подкисленный) эозин, его подкисляют уксусной кислотой, примерно из расчета 1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл раствора эозина.Подкислять лучше спиртовые растворы, ибо подкисленные водные с течением времени могут мутнеть и давать осадки.Прогрессивным методом окраску проводят сначала гематоксилином Эрлиха. Из воды срезы переносят в раствор красителя (в бюксы, на часовое стекло) или капают краситель на предметное стекло. Созревший краситель дает хорошие результаты через 2-3 мин (не более 5 мин). Однако продолжительность окраски зависит не только от самого красителя, но и от объекта. Поэтому на первых срезах определяют продолжительность окраски под контролем микроскопа, а затем строго выдерживают её. Если окраска удачная, ядра клеток имеют интенсивную красновато - фиолетовую окраску, в них хорошо видны ядрышки и глыбки хроматина, цитоплазма не окрашена. При слабой окрашенности ядер в светло – фиолетовый цвет без четкого различия микроструктур – время окрашивания увеличивают. При черной окраске ядер с красноватым оттенком, расплывчатыми структурными элементами и окрашенной цитоплазмой время крашения уменьшают.Установив оптимальное время окрашивания, срезы красят гематоксилином, а затем в течении 3-5 мин отмывают излишки красителя в дистиллированной воде. После этого подсинивают ядра, помещая срезы в щелочную среду. Наиболее употребляемой щелочной средой является водопроводная вода из-за наличия в ней щелочноземельных металлов. Препараты выдерживают в водопроводной воде 10 – 15 минут и больше, пока красновато – фиолетовая окраска ядер сменится на синюю, а затем промывают дистиллированной водой 3-5 минут.регрессивный метод. Ядра сначала перекрашивают (5 – 20 минут), затем промывают в дистиллированной воде и дифференцируют (ослабляют) 1-2 с в подкисленном 70% спирте (5-6 капель крепкой соляной кислоты на 100 мл спирта, что соответствует 1% раствору HCI в 70% спирте), и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски (ослабевает фиолетовый и усиливается красноватый тон ядер).

Прогрессивный метод

1. Гематоксилин Эрлиха 2-5 мин. (регрессивный метод 5-10 мин.)

2. Д истиллированная вода 3-5 мин

3. Д ифференцировка в 1% солянокислом спирте 1-2 сек.

4. Дистиллированная вода

5. Водопроводная вода 10-15 мин. (или дистиллированная с несколькими капельками аммиака)

6. Дистиллированная вода 3-5 мин.

7. Раствор эозина 1% водный 0,5-3 мин (5 раз обмакнуть)

8. Дистиллированная вода 1 мин.

Специальные методы окрашивания

Среди специальных методов окраски можно выделить окрашивание соединительной ткани по Маллори, окрашивание соединительной ткани азур-2-эозином, импрегнацию нервной ткани серебром по методу Бильшовского – Грос.Наиболее популярным специальным методом окраски является окрашивание соединительной и мышечной ткани по методу Ван-Гизона, названного в честь известного американского нейрогистолога, впервые предложившего окраску пикрофуксином.Этим методом коллагеновые волокна окрашиваются в ярко-красный цвет, благодаря чему они резко выделяются среди элементов других тканей, например мышечных и эластических пучков, нейроглии и эритроцитов, окрашивающихся в желтый цвет. В результате окрашивания ядер они становятся темно – коричневыми или буровато-черными при окраске железным гематоксилином Вейгерта и темно-фиолетовым при окрашивании гематоксилином Эрлиха.При окраске по методу Ван - Гизона используется два красящих раствора:а) железный гематоксилин Вейгерта;б) кислая смесь пирофуксина.Гематоксилин Вейгерта готовят перед окраской, смешивая равные объёмы двух основных растворов (Вейгерт I и Вейгерт II), которые хранят отдельно. В готовом виде краска скоро портится ввиду присутствия в ней сильных окислителей.Первый раствор Вейгерта: 100 мл 96% спирта растворяют 1г гематоксилина;Второй раствор: 4 мл 29% раствора полуторахлористого железа сливают с 1 мл соляной кислоты и добавляют 95 мл дистиллир воды.Официнальный раствор полуторахлористого железа представляет собой 50% раствор хлорного железа.Краситель, если он правильно приготовлен, темно- фиолетового цвета, обладает известной стойкостью, сохраняя свой первоначальный цвет около 40 минут. Побурение или позеленение окраски в течение этого времени делает её негодной и свидетельствуют о избытке второго раствора. Ядра таким красителем будут окрашиваться не в черный, в бурый цвет. Правильно приготовленная смесь обладает высокой красящей способностью, интенсивно окрашивает срезы в течение 3-5 минут.Растворы Вейгерта в отдельности можно хранить годами, их смесь не более 3-4 дней, поэтому лучше всего пользоваться свежим раствором.Краска, в которой появился хлопьевидный осадок, негодна для повторного употребления.Раствор пирофуксина можно готовить двумя способами.Первый способ: 150 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты смешивают с 2-5 мл насыщенного водного раствора кислого фуксина (при комнатной температуре в 100 мл дистиллированной воды растворяется около 1,2 г пикриновой кислоты).Второй способ: 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты при комнатной температуре смешивают с 10 мл 1% раствора кислого фуксина. В обоих случаях смеси имеют насыщенный красный цвет.Смесь довольно стойкая, хранится месяцами. Каждая составная часть краски обладает сродством к определенным тканям.Пикрофуксин требует тщательного приготовления. Помимо точного соблюдения соотношений указанных компонентов, краску иногда приходиться подгонять по контрольным препаратам, добавляя в неё то одну, то другую составную часть. В срезах пикрофуксин иногда скоро выцветает. Препарат в таком случае приобретает однотонный желтый цвет и тогда не имеет никаких преимуществ по сравнению с гематоксилин – эозином.Схема окраски по ван – Гизон выглядит так:Гематоксилин Вейгерта – 2-5 минут.Дистиллир вода.Пирофуксин – 3-5 минут.Дистиллированная вода.