Хід роботи
Беруть 1 см2 листкового рослинного матеріалу, кладуть в пробірку.
Додають 400 мкл буферу для лізису і розтирають пестиком до гомогенного стану. Склад буферу для лізису: 250 мМ Тріс (рН 8,0), 250 мМ NaCl, 50 мМ ЕДТО, 0,5%-вий НДС. Інтенсивно перемішують протягом 5 хв на вортексі. Інкубують протягом 20 хв на бані при температурі 65 °С.
Додають 200 мкл 5 М ацетату калію, перемішують. Інкубують протягом 20 хв на льодяній бані. Осаджують клітинні рештки центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв. Відбирають надосад у нову пробірку.
Додають рівний об’єм фенолу, плавно перемішують до одержання гомогенної емульсії. Розділяють водну і органічну фази центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 5 хв. Намагаючись не захопити частинки інтерфази, відбирають водну фазу в чисту пробірку.
Додають рівний об’єм хлороформу, плавно перемішують. Центрифугують при 12000 об/хв протягом 5 хв. Знову обережно відбирають водну фазу в чисту пробірку.
Додають два об’єма холодного 96%-вого етанолу, плавно перемішують до випадання осаду. Для більш повного випадання осаду можна охолодити пробірку за температурою -20 °С протягом 30 хв. Осаджують нуклеїнові кислоти центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв.
Промивають осад 200 мкл 70%-вого етанола, ретельно випарюють етанол. Якщо осад відокремиться від дна, повторюють центрифугування. Висушують осад і розчиняють в 50 мкл води. Розчин ДНК зберігають за температури +4 °С.
Приготування агарозного гелю. Додають розраховану кількість порошку агарози у відповідний об’єм електрофорезного буферу. Концентрацію агарози вибирають в залежності від довжимни фрагментів ДНК.
Суміш нагрівають на водяній бані, доки не розчинеться вся агароза. Охолоджують розчин до 50 ºС і додають водний розчин бромистого етидію (10 мг/мл) до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл.
Заливають розчин в спеціальну ванночку, попередньо встановив гребінку. Після того, як гель повністю застигне прибирають гребінку і поміщають гель в електрофорезну кювету.
Додають достатню кількість електрофорезного буферу так, щоб гель був закритий його шаром на 1 – 2 мм.
Зразки ДНК змішують з буфером і наносять в лунки геля під електрофорезний буфер. Буфер для зразка містить: 0,25% бромфенолового синього, 40% сахарози в воді.
Вмикають електричний струм. За 15 хв. гель виймають і проглядають на транселюмінаторі. З бромистим ітидієм молекули ДНК під впливом УФ світяться яскраво червоним світлом.
Рис. 2. Гель-електрофорез зразків ДНК
3. Використання методів фотоколориметрії та спектрофотометрії в біотехнології рослин
Матеріали, реактиви та обладнання: 1) спектрофотометр; 2) електроплитка; 3) піпетки на 1 мл та 10 мл; 4) пробірки на 25-30 мл; 5) термостійку склянку на 200 мл; 6) дистильована вода; 7) мірна колба на 100 мл; 8) розчин безидину; 9) 0,3% перекис водню; 10) ацетатний буфер рН 4,7.
Рис. 3. Спектрофотометр
Хід роботи
1. Наважку сирого рослинного матеріалу 500 – 750 мг розтерти у ступці з ацетатним буфером.
2. Гомогенат настояти 10 хв., перенести в епендорфи об’ємом 2 мл і центрифугувати 5 хв. 4000 об/хв..
3. Супернатант обережно злити і розбавити у буферному розчині у співвідношенні 1: 5.
4. В кварцові кювети внести по 2 мл екстракту, розчину бензидину, дистильованої води. Далі у контрольну кювету долити 2 мл води та поставити її на каретку фотоколориметру виставити стрілку гальванометру на «0» (червоний світлофільтр). В кювету із дослідним зразком внести 2 мл перекису водню, увімкнути секундомір і визначити час за який стрілка гальванометра досягне протилежного краю шкали.