5. 3. 2. Полімеразна ланцюгова реакція

ПЛР використовується для ампліфікації сегменту ДНК, який знаходиться між двома відомими послідовностями. Два олігонуклеотиди використовуються як праймери для серії синтетичних реакцій, що каталізуються ДНК-полімеразою. ПЛР здійснювали на ампліфікаторі Gene Amp^© PCR System 9700 (Applied Biosystems, США). Загальний об’єм реакційної суміші становив 50 мкл для препаративної ампліфікації фрагментів або 10 мкл для аналітичної реакції.

Склад реакційної суміші для препаративної ПЛР: матриця – 0,1мкг, суміш dNTPs (Fermentas) – 5 мкл (100 мкмоль), буфер 10× - 5 мкл, відповідні праймери – по 5 мкл, Taq ДНК полімераза – 0,5 мкл (1 U, Fermentas), деіонізована вода - до об’єму 50 мкл.

Для аналітичної реакції: матриця – 0,01мкг, суміш dNTPs (Fermentas) – 1 мкл, буфер 10× - 1 мкл, відповідні праймери – по 1 мкл, Taq ДНК полімераза – 0,2 мкл, деіонізована вода - до об’єму 10 мкл.

Температура приєднання праймерів (аннілінг) – визначалася специфічно для кожної пари праймерів.

Використані праймери:

Назва праймера	Нуклеотидна послідовність праймера
Ko653	AAA GCGGCCGC atgtcttctcaagatattcc
Ko678	AAA GCGGCCGC ttaaacatgttcgtcaacag

5. 3. 3. Електрофорез днк в агарозному гелі

Принцип методу: метод базується на здатності негативно зарядженої молекули ДНК рухатися в електричному полі від катода до анода, що дає можливість розділяти та ідентифікувати фрагменти ДНК.

Реактиви:

• агароза

• TAE буфер:

  • 0,04 М тріс-ацетат

  • 0,002 М ЕДТА

• буфер для нанесення проб:

  • 0,1% бромфеноловий синій

  • 0,5% ДСН

  • 0,1М ЕДТА(pH 8.0)

  • 50 % гліцерол

Хід роботи:

Агарозу вносять в TAE буфер, нагрівають до повного розчинення і кип'ятять протягом 3 хв. Коли розчин охолоджується до 50^оC, додають бромистий етидій. Охолоджений розчин заливають у кювету з гребінцем для формування лунок. Необхідно, щоб між дном кювети і гребінцем залишався шар агарози товщиною 0,5-1 мм. Після полімеризації гелю гребінець видаляють, а кювету з гелем поміщають в електрофоретичну камеру з ТАЕ буфером. В лунки вносять виділену ДНК (0,2-0,5 мкг), змішану з буфером для нанесення проб так, щоб об'єм буферу становив 1/6 об'єму кінцевої суміші. Електрофорез проводять при напрузі 2-4 В/см² протягом 30-40 хв. Зони ДНК реєструють, освітлюючи гель ультрафіолетовими променями. Одержану електрофореграму фотографують.

5. 3. 4. Розщеплення днк ендонуклеазами рестрикції

Метод базується на здатності ендонуклеаз рестрикції ІІ класу гідролізувати ДНК в певних сайтах (послідовностях нуклеотидів). В роботі використовували ферменти та відповідні інкубаційні буфери виробництва фірми “Fermentas” (Литва).

У реакційну суміш вносили 0,5-2 мкг аналізованої ДНК в ТЕ-буфері чи бідистильованій воді. До розчину ДНК додавали 1/10 об’єму відповідного буферу і 1 од.акт. ферменту на 1мкг плазмідної ДНК, реакційну суміш доводили водою до відповідного об’эму. Суміш інкубували при 37^оС 1-2 години.