Лабораторное занятие №1 Микроскопический метод, задачи, этапы, характеристика

Цель работы: закрепить знания по строению прокариотической клетки, обучить студентов микроскопическому методу исследования микроорганизмов.

Оборудование, приборы, принадлежности: бактериологические петли, спиртовка, предметные стёкла, штативы, микроскоп, культуры микроорганизмов, красители (растворы фуксина, метиленового синего, генцианвиолета, раствор Люголя).

I. Теоретическая часть

Бактериоскопический (микроскопический) метод - совокупность способов обнаружения и изучения морфологических и тинкториальных свойств бактерий (микробов) в лабораторной культуре, патологическом материале или в пробах из внешней среды с помощью микроскопии.

Задачи микроскопического метода:

1) установление морфологических особенностей микроорганизмов,

2) исследование тинкториальных свойств микробов,

3) оценка чистоты культуры при культивировании микробов.

Микроскопический метод выполняется в несколько этапов:

1) взятие материала для исследования и его доставка в лабораторию,

2) приготовление микроскопического препарата,

3) выбор метода микроскопии и проведение микроскопического исследования,

4) анализ полученных результатов,

5) заключение по результатам исследования.

Материалами для исследования могут быть практически любые среды, потенциально содержащие микроорганизмы, а также культуры микробов, полученные в искусственных условиях путём культивирования.

В лабораторной практике используют следующие виды микроскопических препаратов: 1) висячую каплю; 2) придавленную каплю; 3) тонкий мазок крови, гноя, мокроты и др.; 4) толстую каплю; 5) препарат-отпечаток; 6) фиксированный мазок. Эти препараты имеют различное предназначения и приготавливаются разными способами. В бактериологической практике чаще применяют фиксированный мазок, приготовленный с помощью бактериологической петли.

Перечисленные виды препаратов можно разделить на прижизненные (нативные), с помощью которых можно исследовать подвижность микробов, и фиксированные, пригодные для изучения морфологии (табл.2). Фиксированные препараты предполагают термическое или химическое воздействие на микроорганизмы, которое инактивирует микробы и удаляет воду, подготавливая препарат к восприятию красителей.

Таблица 2.

Типы микроскопических препаратов и методы их микроскопии

Тип мазка	Вид мазка	Изучаемые свойства	Используемый вид микроскопии
Нативные	висячая капля, придавленная капля, толстая капля	Характер движений	Фазовоконтрастная или темнопольная
Фиксированные	тонкий мазок, мазок-отпечаток, фиксированный мазок	Морфология (форма и размер)	Световая, люминесцентная
	тонкий мазок, фиксированный мазок	Внутренняя структура	Люминесцентная, электронная и др.

Приготовление фиксированного мазка проводится в несколько этапов:

1) исследуемый материал наносят на чистое, обезжиренное предметное стекло с помощью бактериологической петли и распределяют по площади в 1 см ². Плотный (густой) материал или культуру из плотной среды вносят бактериологической петлей в каплю физраствора (или воды), тщательно размешивают и распределяют по стеклу на таком же пространстве, как и в предыдущем случае. Величина вносимого материала зависит от предполагаемого количества бактерий в нем. Препарат должен быть таким, чтобы наступило хорошее прокрашивание и обесцвечивание всех бактерий, а также чтобы была возможность наблюдать за единичными бактериями;

2) приготовленный мазок высушивают на открытом воздухе или в теплой струе воздуха (от газовой горелки или воздушного полотенца);

3) препарат фиксируют на стекле для обеспечения безопасности дальнейшей работы, прикрепления бактерий к стеклу, лучшего восприятия ими краски, поскольку структуры убитых бактерий легче и прочнее воспринимают красители;

4) фиксированные мазки окрашивают одним из простых или специальных методов, погружая мазок в краситель или наливая его на препарат так, чтобы вся поверхность препарата была покрыта сплошным слоем красителя, и хорошо просушивают на воздухе. Плохо высушенный препарат дает мутное изображение при иммерсионной микроскопии из-за образования эмульсии. Все методы окраски разделяют на простые и сложные. Простые методы основаны на использовании одного вида красителя (водный фуксин, кристаллический фиолетовый и проч.). В этом случае все микробы окрашиваются одинаково - в цвет красителя. При сложных методах окраски удается выявить тинкториальные свойства микробов (т.е. их отношение к окраске). Эти методы связаны с последовательным нанесением на препарат 2 и более красителей, чередующихся с какой-либо дифференцирующей жидкостью (спирт, кислота), вымывающей предыдущий краситель из бактерий и обесцвечивающий их. Примеры представлены в таблицах 4,5, посвященных технике и механизмам окраски мазков сложными методами.

5) микроскопия мазка.

Ценность бактериоскопического (микроскопического) метода состоит в простоте, доступности методик и быстроте получения результатов (30-60 мин и менее). Однако специфичность его в связи с близостью морфологии разных видов мала, чувствительность ограничена (около 10⁵ бактерий в 1 мл), информация, полученная с его помощью, невелика.

Результаты бактериоскопического метода обычно можно использовать как ориентировочные в основном для индикации высоких таксонов. Специфичность и разрешающая способность метода резко возрастают при использовании флуоресцентных и иммунофлуоресцентных методик (табл.3).

Таблица 3.

Увеличение возможностей микроскопии при использовании явления флуоресценции

Виды микроскопии	Пространственное разрешение	Исследуемые параметры	Возможность иденти-фикации на уровне вида
Световая	 0,2 мкм	только морфологические	нет
Флуоресцент-ная	 0,05 мкм	морфологические и функциональные (например, жизнеспособность, синтез белка, нуклеиновых кислот и проч.) - за счет имеющихся природных и синтетических флуоресцирующих красителей, избирательно связывающихся с разными веществами (ДНК,РНК) и структурами клетки. Рисунок 1. Препарат окрашен акридиновым оранжевым: живые микробы с высоким уровнем синтеза НК - зеленого цвета, погибшие микробы - оранжевые	да, при использовании иммунофлуоресцентного метода (флуорохром связан с антителами, специфичными исследуемому микробу. В этом случае визуализи-руются только связавшие метку микробы). Рисунок 2. Препарат (аналогичный изображенному на рис.1) обработан антителами к E.coli, меченными ФИТЦ (флуорохром). Эти антитела связались только соответствующи-ми бактерииями, кокки и палочки др. вида не визуализируются. В пре-парате идентифицированы E.coli

В большинстве случаев микроскопические препараты из бактерий подвергают сложным методам окраски. К таким методам относятся метод Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Гинса-Бурри и другие (табл.4,5). Сложные методы основаны на различиях избирательности прокрашивания разных клеточных структур, что позволяет идетифицировать разные группы микробов по тому или иному признаку.

Таблица 4.