Другие плазмидные векторы
Эпоха вектора pBR322, начатая Боливаром и Родригесом в самом начале 80-тых годов ХХ-го столетия, продолжается и по сей день. Однако, при всей своей надежности и классическом соответствии всем необходимым для векторов требованиям, этот вектор имеет всего несколько удобных сайтов для клонирования. Кроме того, отбор трансформированных клеток в экспериментах с рекомбинантными ДНК на его основе занимает много времени. Возникла необходимость разработки альтернативных, более совершенных, систем клонирования. Так была создана группа векторов семейства pUC. В названии векторов этого семейства буквы ”U” и “C” – это первые буквы от слов University of California. Исследователями этого университета была создана серия векторов, имебющих важную черту– наличие в структуре ДНК встроенного синтетического полилинкера, который представляет собой последовательность нуклеотидов, составленную из сайтов узнавания ряда эндонуклеаз рестрикции, уникальных для данного вектора - MCS (Multiple Cloning Sites). Названия индивидуальных векторов из семейства pUC отличаются двузначным числом, а первичная структура разных векторов отличается составом сайтов MCS MCS – Multiple Cloning Sites в полилинкере.
Рассмотрим подробнее особенности векторов, входящих в эту группу, на примере вектора pUC19 (рис. 21).
Плазмида pUC19 имеет длину 2686 п. н. и содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ') лактозного оперона E.coli, ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ'; полилинкер — короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, ХmаI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HinсII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации плазмиды ColE1.
Рис. 21. Плазмидный вектор pUC19
Объяснение к карте дано в тексте.
Присутствие в плазмиде pUC19 гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, позволяет отбирать клоны E.coli, содержащие данный вектор или рекомбинантные ДНК на его основе на питательных средах с этим антибиотиком. Такие модульные элементы структуры рассматриваемого вектора как lacZ', lacI и MCS дают возможность ускорить и интенсифицировать процедуру селекции клонов с рекомбинантными ДНК.
Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду pUC19, выращивать в присутствии изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), который является индуктором lac-оперона, то продукт гена lacI, так называемый репрессор, не сможет связаться с промоторно-операторной областью гена lacZ', и как следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена lacZ'. Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК (α-комплементация), и в результате образуется активная ß-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ' так, что она не влияет на продукцию функциональной β-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal), то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную, т.е. без вставки чужеродной ДНК, плазмиду pUC19 (рис. 22).
Рис. 22. Последовательность процедур клонирования ДНК в векторе pUC19.
1, 2, 3 и 4 – этапы клонирования (см. текст)
Донорную ДНК обрабатывают одной из эндонуклеаз рестрикции, для которой имеется сайт в полилинкере. Векторную ДНК pUC19 обрабатывают тем же ферментом
Лигирование линеаризованного вектора и вставки с помощью ДНК-лигазы Т4.
После процедуры лигирования инкубационной смесью проводят трансформацию клеток, способных к α-комплементации, которые могут синтезировать ту часть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с продуктом гена lacZ' с образованием активного фермента.
Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для ß-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную, т.е. рекомбинантную, плазмиду, образуют на той же самой среде белые колонии. Это связано с тем, что обычно при встраивании в полилинкер чужеродной ДНК не может образовываться полноценный продукт гена lacZ', и, следовательно, в процессе α-комплементации не образуется активная ß-галактозидаза, расщепляющая субстрат X-Gal до продукта, который и обеспечивает окрашивание клеток колоний в синий цвет.