1. Постановка ра в пробирках (развернутая ра)

Оборудование: 1) пробирки химические и центрифужные; 2) центрифуга на 2-3 тыс. оборотов; 3) пипетки объемом 10 и 5 мл с делениями на 0,1 мл; 4) градуированные цилиндры; 5) штативы с гнездами, 6) термостат, водяная баня.

Реагенты: 1) сыворотка крови, подлежащая исследованию, 0,1—0,2 мл; 2) физиологический раствор; 3) корпускулярный антиген: взвесь живой 20-часовой культуры микробов. Используются культуры только в S-форме (гладкие, блестящие колонии с ровными краями).

Ход работы. Приготовление разведений сыворотки:

Из сыворотки приготовить ряд последовательных разведений, от 1:50— 1:100 до 1:1600— 1:3200. В отдельной пробирке приготовить первое разведение сыворотки 1:50 или 1:100. Для этого пипеткой набрать 0,1 мл сыворотки, другой пипеткой добавить к ней 4,9 мл (1:50) или 9,9 мл (1:100) физиологического раствора. Основной раствор сыворотки используется для приготовления последовательных, двукратных разведений.

По окончании разведений во все пробирки ряда (кроме контрольной) прибавить по 2—3 капли антигена.

Контроль: 1) изотонический раствор хлорида натрия с микробными антигенами, 2) исследуемая сыворотка без антигена.

Пробирки встряхнуть и поставить на 2 часа в термостат при температуре 37 °С.

Через 2 часа подвести предварительный результат реакции – начать учет реакций с контрольных пробирок. Если нет агглютинации в контрольных пробирках и есть хлопья в 2-3 и более пробирках, то говорят о положительной реакции. Окончательный результат реакции агглютинации регистрировать на следующий учебный день (через 18—20 часов стояния пробирок при комнатной температуре). Определить титр сыворотки.

Результат РА охарактеризовать, используя систему четырехкрестового обозначения:

+ + + +— полная агглютинация, при которой большой осадок на дне располагается кучкой или в форме открытого перевернутого зонтика. Надосадочная жидкость прозрачная;

+ + + — почти полная агглютинация, осадок такой же, надосадочная жидкость почти прозрачная;

+ + — слабая агглютинация, осадок едва заметен, жидкость непрозрачная;

+ — отмечаются следы агглютинации;

- — отрицательная реакция, содержимое пробирки равномерно мутное.

Оформление работы. Зарисовать схему постановки опыта, подписать пробирки с разведением, отметить результат реакций.

2.2 Постановка ра на стекле (ориентировочная ра)

Оборудование: предметные стекла, лотки, стеклянные мостики, пипетки, бактериальные иглы и петли, спиртовки, лупы.

Реагенты: сыворотка, бактериальная культура на плотной питательной среде, физраствор

Ход работы. На стеклянные мостики над лотками уложить предметные стекла из расчета постановки на каждом стекле по три реакции (в центре и по краям стекла). На поверхность обезжиренного предметного стекла нанести с помощью пипетки по 2 капли агглютинирующей сыворотки каждого разведения (по предыдущей работе). На последнем стекле внести каплю изотонического раствора (контроль).

В сыворотку внести исследуемую бактериальную культуру, снятую с поверхности плотной питательной среды бакиглой или пипеткой. Внесенную культуру перемешать. Через 5—10 мин. при комнатной температуре просмотреть стекла через лупу, записать результат.

При положительной реакция в капле отмечается окучивание бактерий в виде зернышек или хлопьев, при отрицательной – жидкость остается прозрачной.

Оформление работы. Схематически зарисовать постановку опыта, записать результаты.

Работа 3. Реакция кольцепреципитации.

Оборудование: 4 пробирки, штатив, спиртовка, пипетка.

Реагенты: сыворотка, баккультура жидкая (3 разновидности), физраствор.

Сыворотку вносить в пробирку аккуратно так, чтобы она не попала на стенки пробирки, а исследуемый материал (микроорганизмы) должен наслаиваться на сыворотку, стекая по стенки пробирки (для этого пробирку держать под наклоном).

Ход работы. Подписать маркером пробирки. Внести во все пробирки по 1 мл сыворотки. Затем в 1-3 пробирки (опыт) внести по 1 мл различного исследуемого бакматериала, в 4 пробирку (контроль) –1 мл физраствора. Сделать вывод об антигенной чувствительности животного по образованию кольцепреципитата.

Оформление работы. Зарисовать схематически ход работы, отметить результаты.

Работа 4. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева

Оборудование: микроскоп, камера Горяева, пипетка, капилляр от гемометра Сали, пробирка с резиновой крышкой.

Реагенты: жидкость Тюрка (100 мл 5%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего), спирт, иммерсионное масло.

Камера Горяева – толстое предметное стекло с четырьмя желобами в средней части, между которыми находятся три узкие площадки, средняя из которых ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесенные на стекло. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 расчерчены вертикальными и горизонтальными линиями на 16 малых квадратов. Подсчет лейкоцитов ведут в счетной камере Горяева под малым увеличением микроскопа в 100 неразграфленных больших квадратах. Большой квадрат равен 16 малым, что соответствует 100 х 16 = 1600 малым квадратам. Единицей отсчета является маленький квадрат. Его сторона равна 1/20 мм, площадь 1/20*1/20=1/400 мм². Объем крови, помещающейся над маленьким квадратом, равен 1/400 мм²*1/10 мм=1/4000 мм³ (1/10 мм – высота слоя крови). из 225 больших квадратов

Ход работы. Покровное стекло притереть к камере Горяева до появления радужных колец.

Установить увеличение микроскопа в 280 раз (окуляр на 7, объектив на 40). Поставить камеру на предметный столик микроскопа, найти сетки, рассмотреть.

Пипеткой взять 0,4 мл жидкости Тюрка (5%-ый раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим) и влить в пробирку.

Набрать кровь в капилляр от гемометра Сали до отметки (0,02 мл); кончик капилляра вытереть ватой; опустить капилляр в пробирку с жидкостью Тюрка; выдуть кровь в пробирку; промыть капилляр, дважды выдувая этот раствор разбавителя. Пробирку закрыть резиновой пробкой, перемешать содержимое. Набрать содержимое пробирки в капилляр. Каплю из капилляра выпустить на среднюю пластинку под притертое покровное стекло к камере Горяева (пузырьки воздуха не должны попасть под покровное стекло). Оставить на 1 мин., чтобы осели клетки крови.

Подсчитать количество лейкоцитов в 100 больших квадратах (или 1600 малых квадратах). Учитывают клетки, находящиеся внутри каждого малого квадрата, на левых и верхних сторонах каждого квадратика. Не считают на нижних и правых сторонах квадрата, т.к. их число учитывается при подсчете лейкоцитов следующего квадрата.

Рассчитать содержание лейкоцитов в 1 м³ крови. Для этого использовать формулу:

Х=(А*4000*20)/1600, где

А – количество лейкоцитов в 100 больших квадратах,

4000 – коэффициент для приведения объема к 1 мм³ (1/4000 мм³ – объем одного маленького квадрата),

20 – коэффициент разведения крови объемом 0,02 мл,

1600 – количество маленьких квадратов.

Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля (или подсчитанное число клеток крови разделить на 50), ошибка метода составляет ± 7%.

Например, подсчитано 160 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 8 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (система единиц СИ) необходимо результат умножить на 10⁶, т.е. 8 000*10⁶= 9*10⁹/л.

Оформление работы. Записать или зарисовать последовательность счета клеток в камере Горяева. Подсчитать количество клеток, записать.

Работа 5. Приготовление мазков крови, окрашивание по Романовскому-Гимзе

Оборудование: обезжиренные предметные и шлифовальные стекла, вата, пинцет, пипетка на 10 мл, глазные пипетки, ванночки размером с предметное стекло, карандаш.

Реагенты: кровь рыбы, 70 % этиловый спирт,

В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. Окрашиватся ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.

Ход работы. Обезжирить предметные стекла

Предметное стекло взять в левую руку между большим и указательным пальцами за короткие грани.

Каплю крови (величиной с зерном пшена) нанести на правый конец стекла (предметным стеклом, углом шлифовального стекла, пипеткой). Капля должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из нее, не доходил на 1 см до края стекла.

Шлифовальное стекло ставят под углом 45º к основному стеклу у правого края предметного стекла, надвигают на каплю крови так, чтобы у нижнего ребра шлифовального стекла равномерно распределилась капля крови. Распределяют справа налево каплю крови по предметному стеклу равномерно, быстро. Мазок должен быть тонким, ровным, желтоватым, просвечивающимся и отливать должен цветами радуги при просмотре на свет.

А Б В Г Д

А – неравномерный мазок на плохо обезжиренном стекле; Б – короткий мазок; В – длинный и неравномерный мазок; Г – толстый в начале мазок; Д – правильный мазок.

Рисунок 2. Качество приготовленного мазка.

Высушить мазок быстро (под лампой, в термостате, высоко над спиртовкой).

Промаркировать простым карандашом.

Фиксировать в закрытой кювете в этиловом спирте 5 мин., высушить на воздухе.

На дно ч.Петри налить готовую краску Романовского, препарат уложить мазком вниз в краску, закрыть крышкой от ч.Петри (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). Мазки окрашивать 20 — 25 минут во влажной камере в термостате при 37 °C.

После окрашивания мазки промыть в проточной воде, сушить на воздухе и исследовать при масляной иммерсии.

Оформление работы. Записать последовательность методики окрашивания.

Работа 6. Выведение лейкограммы.

Процентное соотношение различных форм лейкоцитов называют лейкограммой, изучению которой, как и общему подсчету лейкоцитов придается большое значение в клинике. Увеличение количества лейкоцитов называют лейкоцитозом, а уменьшение - лейкопенией.

Продолжительность жизни гранулоцитов максимум 1,5-2дня, потом уходят в ткани и через 1-2 дня гибнут. В-лимфоциты - до 2 недель, Т-лимфоциты - месяцы.

Расчет лейкоцитов.

Четырёхпольный метод - по Шиллингу - определяют количество лейкоцитов в четырёх участках мазка. Всего в мазке подсчитывают 100—200 клеток.

Трёхпольный метод - метод Филиппченко - состоит в том, что мазок мысленно делят на 3 части: начальную, среднюю и конечную. Подсчёт ведут по прямой линии поперёк мазка от одного его края к другому. В каждой части подсчитывают одинаковое количество клеток. Всего учитывают 100-200 лейкоцитов.

Окрашивание клеток.

Бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток — в голубой, ядра — в красный. При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра — красно-фиолетовый. Результаты окрашивания мазков крови:

цитоплазма лимфоцитов окрашивается в сине-голубой цвет, их ядра - в цвета от интенсивно пурпурного до фиолетового;

цитоплазма моноцитов окрашивается в мутный голубовато-серый цвет, их ядра - в более светлый пурпурно-красный, нежная азурофильная зернистость;

гранулы базофилов окрашиваются в интенсивный сине-фиолетовый цвет;

гранулы эозинофилов окрашиваются в оранжево-розовый цвет;

гранулы нейтрофилов окрашиваются в цвета от пурпурного до фиолетового;

ядра лейкоцитов фиолетово-красного цвета с хорошо видимой структурой хроматина; хорошо выделяются ядрышки;

г рануломеры тромбоцитов окрашиваются в красный, гиаломеры - в голубой; розовая окраска гемоглобина.

Рисунок 4. Форменные элементы в крови карпа

1 - гемоцитобласт;

2 - миелобласт;

3- промиелоцит;

4 - нейтрофильный миелоцит,

5 - нейтрофильный,

6, 7 - базофильные и 8 - псевдоэозинофильный метамиелоциты;

9, 10 - палочкоядерный и сегментноядерный нейтрофилы;

11 - моноцит;

12 - 15 - лимфоциты;

16 - 21 – эритроциты

Рисунок 3. Форменные элементы крови человека в мазке.

1 – эритроцит,

2 – сегментоядерный нейтрофильный гранулоцит,

3 – палочкоядерный нейтрофильный гранулоцит,

4 – юный нейтрофильный гранулоцит,

5 – эозинофильный гранулоцит,

6 – базофильный гранулоцит,

7 – большой лимфоцит,

8 – средний лимфоцит,

9 – малый лимфоцит,

10 – моноцит,

11 – тромбоциты (кровяные пластинки).

Реактивы: смесь Никифорова, иммерсионное масло.

Оборудование: микроскоп, стекла с готовыми мазками крови, окрашенные по Романовскому.

Ход работы. Смесью Никифорова протереть объектив. Установить предметное стекло на рабочий столик микроскопа, на 4 краевые участка мазка нанести иммерсионное масло, на один из них установить объектив на 90.

Объективом просматривать от края мазка к центру по ломаной кривой, возвращаясь к краю от центра. Сосчитать 25 лейкоцитов, отметить формы, перейти на следующий краевой участок. Так подсчитать 100 лейкоцитов в 4 участках, учитывая формы

Определить процентное содержание клеток различных популяций в исследуемом образце. Процентное содержание лейкоцитов различного вида не отвечает истинному количеству в 1 мл крови. Для того чтобы получить эту величину, необходимо произвести расчет абсолютного содержания лейкоцитов в 1 мл крови, зная при этом как количество лейкоцитов, подсчитанных в камере Горяева (Работа 4 данного лабораторного практикума), принимая за 100%, так и количество соответствующих видов лейкоцитов, например моноцитов, подсчитанных в мазках крови, в процентах.

Более упрощенно этот расчет проводится путем умножения первых двух цифр числа лейкоцитов, подсчитанных в камере Горяева, на число соответствующего вида лейкоцитов, подсчитанных в мазке крови. Если лейкоцитов имеется 10000 и более, то следует брать первые три цифры.

Например, число лейкоцитов равно 8000 в 1 мкл крови, а число моноцитов – 4%.

80× 4 = 320 моноцитов в 1 мкл крови.

Оформление работы. Вывести лейкограмму крови карпа и человека, сравнить.

Работа 7 . Определение жизнеспособности фагоцитирующих клеток

Перед использованием суспензий клеток в иммунологических реакциях, как правило, проверяется их жизнеспособность. Жизнеспособность клеток можно определять методом окрашивания 0,1% трипановым синим или его сме­сью с эозином. Ядра погибших клеток окрашиваются трипановым синим, а их цитоплазма - эозином.

Реагенты: раствор трипанового синего 0,1%; фосфатно-буферный раствор (рН=7,2-7,4); раствор эозина 0,1 %; двойной раствор Хенкса без глюкозы (Раствор Хенкса: хлорид натрия (8,00 г/л); хлорид кальция (0,20 г/л); сульфат магния (0,20 г/л); хлорид калия (0,40 г/л);, КН₂Р0₄ (0,10 г/л); бикарбонат натрия (1,27 г/л); глюкоза (2,00 г/л). Все вещества растворяют в 1 литре дистиллированной воды).

Оборудование: термостат 37°С; камера Горяева; микроскоп с увеличением 10x40; пипетки.

Ход работы. Готовят раствор трипанового синего в фосфатно-буферном растворе (рН=7,2-7,4) или в физиологическом растворе (0,1% раствор эозина на двойном растворе Хенкса без глюкозы). К клеточной суспензии добавляют равный объем раствора красителя (при использовании двух красителей их растворы предварительно смешивают). Инкубируют при 37°С в течение 3 минут. С помощью микроскопа в камере Горяева подсчитывают процент по­гибших клеток (окрашенных). Жизнеспособность клеток выражают в процен­тах живых клеток - она должна быть не менее 95—93%, т.е. число окрашенных клеток не должно превышать 5-7%.

Оформление работы. Рассчитать количество жизнеспособных фагоцитирующих клеток.

Работа 8. Фагоцитарная активность лейкоцитов

Судьба микроорганизмов, захваченных лейкоцитами, может иметь три исхода:

1) полное внутриклеточное переваривание микробов, приводящее к их исчезновению в лейкоците, — завершенный фагоцитоз;

2) выталкивание микробов из лейкоцитов обратно, в окружающую среду;

3) активное размножение микробов внутри лейкоцитов, — незавершенный фагоцитоз.

В последнем случае фагоцитоз приобретает отрицательное значение для организма, так как микробы, находящиеся внутри клеток, становятся менее доступными действию антител. Незавершенный фагоцитоз имеет место при заболевании туберкулезом, бруцеллезом, туляремией, гонореей.

Фагоцитарная активность (ФА) лейкоцитов выражается процентом активных лейкоцитов (фагоцитов, т.е. тех, внутри которых есть микроорганизмы) к общему числу подсчитанных лейкоцитов данной группы. Например, при определении ФА нейтрофилов, находящихся в процессе фагоцитоза, учитывают к общему числу только нейтрофилов.

Фагоцитарный индекс (ФИ) – среднее число фагоцитированных частиц из расчета на одну клетку из числа выявленных. С помощью ФИ определяют опсонирующую способность исследуемой крови, т.к. присутствие в плазме крови антител, комплементарных антигенам конкретного возбудителя, способствует повышению эффективности фагоцитоза.

Фагоцитарное число характеризует агрессивность лейкоцитов и вычисляется делением числа фагоцитарных бактерий на общее число подсчитанных лейкоцитов.

Фагоцитарная емкость характеризует общую фагоцитарную активность крови, определяется количеством микробных тел, фагоцитированных лейкоцитами 1 мм³ крови.

Опсонофагоцитарный индекс (ОФИ) – отношение фагоцитарного индекса анализируемой крови к фагоцитарному индексу нормальной крови. Чем выше он, тем больше специфических антител в крови и можно оценить уровень иммунного ответа исследуемого.

Оборудование: центрифужные прорбирки, центрифуга, термостат, пастеровские пипетки, микроскоп.

Реагенты: лимоннокислый натрий 2%-ый, спирт, кровь животного, суточная культура микроорганизмов на скошенном агаре – непатогенные стафилококки, Candida и др., красители по Романовскому-Гимзе.

В пробирки с микроорганизмами внести 2 мл 2% р-ра цитрата натрия, аккуратно встряхивая пробирки смыть микроорганизмы со скошенного агара.

В стерильную центрифужную пробирку налить 0,2 мл 2% лимоннокислого натрия, добавить 0,1 мл исследуемой крови рыбы и 0,5 мл микробной взвеси. Пробирку осторожно встряхнуть, поместить на 30 мин в термостат при температуре 37°С.

Затем смесь центрифугировать при 2000—3000 обмин до расслоения жидкости на верхний — соломенно-желтый прозрачный слой плазмы, нижний — слой эритроцитов и среднюю серебристую пленку между ними — слой лейкоцитов. Пастеровской пипеткой отсасывают вначале верхний слой, затем очень осторожно снимают средний, делают из него 3—5 мазков и окрашивают их по Романовскому (Работа 5 настоящего лаб. практикума).

При микроскопии мазка подсчитать:

1) число фагоцитировавших нейтрофильных лейкоцитов из общего числа подсчитанных 100 лейкоцитов, результат выразить в процентах. Норма – 20-40%.

2) фагоцитарный индекс (количество фагоцитированных микроорганизмов в 100 нейтрофильных лейкоцитах) и определить среднее количество фагоцитированных микроорганизмов в одной клетке. Норма – 3 и более микроорганизмов,

3) опсонофагоцитарную пробу. У каждого из 25 нейтрофилов подсчитать количество фагоцитированных микроорганизмов, согласно числу последних определить группу лейкоцитов:

группа 0 – нейтрофилы, внутри которых нет микроорганизмов,

группа 1 – нейтрофилы, внутри которых 1-20 клеток микроорганизмов,

группа 2 – 21-40 клеток,

группа 3 – свыше 40 клеток микроорганизмов.

Схема определения ОФП: а) определить количество нейтрофилов в каждой группе, б) перемножить количество лейкоцитов на номер группы, в) суммировать результаты.

Максимальный показатель ОФП может быть равен 75. Норма (у здоровых людей) – 1-3. Если показатель 10-24 – слабо положительная реакция, 25-49 – ясно выраженная, свыше 49 – резко положительная.

4) ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза:

ИЗФ = Среднее число поглащенных микробов через 30 мин / Среднее число поглащенных микробов через 120 мин.

В норме через 30 мин. начинается переваривание поглощенных микробов клетками, через 2 часа оно должно закончиться. Поэтому процент фагоцитирующих лейкоцитов и среднее число поглощенных микробов после 2-х часовой инкубации меньше, чем после 30-мин. Инкубации. Например, из 100 подсчитанных лейкоцитов 20 участвовали в фагоцитозе и фагоцитировали 100 микробных тел. Отсюда фагоцитарная активность равна 20%; фагоцитарный индекс – 100 : 20 = 5; фагоцитарное число – 100 : 100 = 1; фагоцитарная емкость равна единице, умноженной на количество лейкоцитов у данного животного.

Оформление работы. Записать порядок расчета фагоцитировавших нейтрофилов (%), фагоцитарный индекс, опсонофагоцитарный показатель, индекс завершенности фагоцитоза.

Работа 9. Изучение лизоцимной активности слюны.

Оборудование: чашки Петри со стерильным МПА, флакончик со стерильными дисками из фильтровальной бумаги (диаметр дисков - 6 мм), стерильные пробирки, флакончики или чашки Петри для взятия исследуемого материала. Стерильные пастеровские и градуированные пипетки. Спиртовка, растворы красителей для окраски по методу Грама, фильтровальная бумага, прибор для промывания мазков, пинцет, иммерсионное масло, микроскоп, измерительная линейкa.

Реагенты: Односуточная бульонная культура Micrococcus lysodeicticus или смывы с денег стирильным физраствором. Слюна студентов (курящих и некурящих).

Ход работы. Лизоцим - белок-фермент (мурамидаза). Он разрушает клеточную стенку бактерии, в результате чего происходит ее растворение. Лизоцим действует на один из основных компонентов бактериальной клетки - на гликопептиды бактерий.

Приготовить мазок из односуточной бульонной культуры M.lysodeicticas или из смыва с денег, окрасив его по методу Грама.

Стерильной градуированной пипеткой внесите односуточную бульонную культуру M.lyeodeicticus в чашки Петри с МПА (0,4 мл) и с помощью шпателя, изготовленного из пастеровской пипетки, равномерно распределите культуру, слегка втирая ее, по всей поверхности агаровой среды. Затем поставьте чашки в термостат на 2 часа для подсушивания, чтобы не допустить растекания проб исследуемого субстрата.

Подготовьте две пробы исследуемого материала - слюны, поместив каждую в отдельную стерильную пробирку, флакончик или чашку Петри. Соблюдая правила стерильности при работе, откройте вблизи пламени спиртовки флакончик с дисками, с помощью пинцета захватите щепотку дисков и внесите их во взятые пробы, затем после пропитывания дисков исследуемым субстратом разложите их в 4-6-повторениях на поверхность МПА в чашках Петри, засеянных тест-культурой M.lysodeicticus. Чашки с дисками поставьте в термостат на 24 часа.

Лизоцимную активность исследуемого материала определяют по зонам задержки роста (ЗЗР) тест-культуры вокруг дисков. При просмотре чашки в проходящем свете, зоны задержки роста тест-культуры выглядят прозрачными и четко вырисовываются на бактериальном фоне выросшей культуры M.Lysadeicticus в виде мелких колоний. С помощью линейки измерьте диаметр ЗЗР. Оценку лизоцимной активности дайте по показателям: слабая – диаметр ЗЗР от 7 до 7,5 мм; средняя – диаметр ЗЗР от 7,6 до 8,5 мм; сильная – диаметр ЗЗР от 8,6 мм в выше.

Оформление работы. Рассчитать ЗЗР у каждой пробы, сделать вывод о влиянии табакокурения на лизоцимную активность слюны и общую резистентность организма.

Работа 10. Изучение лизоцимной активности яичного белка птиц.

Оборудование:.Те же, что и в предыдущих опытах, но вместо коротких пробирок на каждую пробу яйца нужно иметь по 6 бактериологических пробирок с 9 мл стерильного физиологического раствора.

Реагенты: физраствор; яйца птичьи (1. промышленного производства куриные, 2. домашние куриные, 3. куриные фабричные с селеном, 4. перепелиные).

Ход работы. Тупой конец яйца протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, скорлупу надкалывают, не нарушая подскорлуповой оболочки, удаляют пластинку скорлупы, в образовавшееся отверстие вводят стерильную пипетку и, не касаясь желтка, набирают 1 мл белка и вносят в первую пробирку с 9 мл физиологического раствора. Белок с помощью пипетки осторожными круговыми движениями тщательно размешивают в физиологическом растворе до исчезновения сгустков.

Получив в первой пробирке разведение белка 1:10, переносят из нее 1 мл содержимого во вторую пробирку с 9 мл физиологического раствора, размешивают, набирают пипеткой 1 мл, переносят в третью пробирку и тем же способом - в последующие до разведения яичного белка 1:1000000.

В пробирки каждого разведения яичного белка, начиная 1:100 погружают стерильные диски из фильтровальной бумаги. Одновременно подготавливают чашки Петри, засеянные культурой M.lysodeieticus по методике, описанной в работе 9. Каждую чашку, предназначенную для исследования одной пробы яичного белка, расчерчивают восковым карандашом с наружной стороны дна на пять секторов, обозначив разведения: 1:100, 1:1000, 1:10000; 1:100000; 1:1000000 , уменьшая при этом площадь сектора по мере возрастания степени разведения яичного белка.

С помощью пинцета из пробирок с разведениями яичного белка извлекают диски и в количестве 3-4 раскладывают соответственно, в каждый обозначенный сектор чашки Петри на поверхность МПА, засеянного тест-культурой M. lysodeicticus. Затем чашки ставят в термостат на 24 часа крышками вниз во избежание размыва выросших на агаровой среде колоний конденсационной водой.

В процессе манипуляции с яичным белком следует учитывать, что работа должна проходить в условиях соблюдения правил стерильности, с использованием горящей спиртовки. Пробирки после взятия из них пипеткой разведений яичного белка снова должны закрываться ватными пробками.

Лизоцимную активность яичного белка учитывают по показателям зон задержки роста (ЗЗР)) тест-культуры, начиная с разведения 1:100 со следующей оценкой: слабая – в разведении 1:100; средняя – в разведении 1:1000 - 1: 10000; сильная – в разведении 1:100000 - 1:1000000.

Оформление работы. Расчитать ЗЗР микроорганизмов вокруг бумажных дисков в ч.Петри в проходящем свете, сделать выводы о силе лизоцимной активности белка птичьих яиц в зависимости от вида птиц, от характера кормления кур.

Работа 11. Пробиотические микроорганизмы молочнокислых продуктов питания.

Оборудование: ч.Петри, спиртовки, шпатель Дригальского, бакпетля.

Реагенты: фармацевтические бакпрепараты («Диалакт», «Бифидумбактерин», «Лактобактерин» и др.), молочнокислые продукты питания торговой сети, скарификат стенки средней кишки кролика или фекалии кролика, спирт.

Ход работы. Для получения молочнокислой закваски из фармацевтических сухих бакконцентратов молоко прокипятить, дать ему остыть до 37 ^oC. Затем сухой бакконцентрат активизировать в стерилизованном молоке в термостате в течении 10 ч. После активации (созревания) бактерий в молоке получается закваска, которая по внешнему виду напоминает домашний кефир.

Для получения равномерного бактериального газона на твердой среде МПА с целью дальнейшего изучения антагонистических свойств микрофлоры скарификат предварительно растворить в 5 мл физраствора и по 0,1 см³ исследуемого продукта вносить на застывший МПА, растиреть стеклянным шпателем по среде. Инкубировать при 37°С 18 ч. Для получения бактерий фекалий объект исследования собрать с пола клетки животного сразу после акта дефекации и поместить в чистую стерильную посуду. Исследовать не позднее 1 часа после дефекации, растворяя фекалии в течении 20 мин в физрастворе в соотношении 1:10. Затем 0,1 мл биосубстрата внести стерильной пипеткой на плотную среду, растереть шпателем, инкубировать при 37°С 18-24 ч.

Затем пастеровской петлей наносить изучаемый биосубстрат (без серии предельных разведений), проводя волнообразную линию по поверхности МПА - посев штрихом. Через сутки инкубирования (при 37°С) изучить бактериостатическую и бактерицидную деятельность молочнокислых бактерий на гнилостную микрофлору кишечника, оценивая зону лизата вдоль штриха внесенных пробиотиков. Чашки просматривать на свет. Зону угнетения жизнедеятельности бактерий кишечника оценивать в рангах:

I ранг – зарастание зоны штриха пробиотиков на 95% микроорганизмами кишечника, следовательно, проявление антагонизма минимально.

II ранг - частичное зарастание зоны штриха на 75-50%,

III ранг – частичное зарастание зоны штриха менее 50%,

IY ранг - нет зарастания зоны штриха (зарастание до 5%) – максимальное проявление характера антагонистических межвидовых взаимоотношений.

Оформление работы. Составить отчет о характере бактерицидного и бактериостатического действия молочнокислых продуктов питания торговой сети и активированных бактериальных фармацевтических препаратов в лабораторных условиях.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Романова, Л.К. Признаки общего и легочного воспаления у детей первого года жизни, оперированных по поводу врожденных пороков сердца / Л.К. Романова, Л.А. Бокерия, А.В. Трепаков, Л.Ф. Макарова и др. // Иммунология, 2008, т.29, №1, с.24 – 27.

2. Авдеева, Ж.И. Лекарственные препараты моноклональных антител / Ж.И. Авдеева, Н.А. Алпатова, Р.А. Волкова, Л.К. Лаптева // Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней : материалы всерос. науч.-практ. конф., Москва, 9-10 ноября 2010 г. – Москва, 2010. – С.15 – 16.

3. Позднякова, А.С. Состояние иммунологической реактивности детей с латентной туберкулезной инфекцией / А.С. Позднякова, Д.Т. Леви, Е.С. Хитеева // Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней : материалы всерос. науч.-практ. конф., Москва, 9-10 ноября 2010 г. – Москва, 2010. – С. 96.

4. Осидак, Л.В. Гриппферон : метод. пособие для врачей / Л.В. Осидак, В.П. Дриневский, П.Я. Гапонюк ; ГУ Научно-исследовательский институт гриппа РАМН. – Санкт-Петербург, 2009. – 58 с.

5. Тархан-Моурави, И.Д. Патогенетические механизмы действия аэрозольтерапии циклофероном при хронических ринитах / И.Д. Тархан-Моурави, М.М. Ломая // Аэрозольная терапия заболеваний дыхательных путей : рекомендации для врачей, под ред. Проф. М.Г. Романцова. – Санкт-Петербург, 2011. С. 16 – 23.

6. Поворова, О.В. Функциональная характеристика иммунной системы при иммунозависимых воспалительных заболеваниях детей Климовического района Могилевской области / О.В. Поворова, Л.Г. Борткевич, Т.А. Сапунова, В.В. Блинов // Веснiк МДУ iмя А.А.Кулешова. – 2006. - № 1 (23). С. 178-183.

7. Бронштейн, А.М. Трихинеллез : информационно-методическое пособие. / А.М. Бронштейн, В.П. Сергиев, О.Г. Полетаева и др. – Москва, 2004. 32 с.

49