23. Регуляция активности ферментов: химическая модификация фермента, аллостерическая регуляция.

1. Химическая модификация фермента - активность ряда ключевых ферментов обмена углеводов, в частности фосфорилазы, гликогенсинтазы и др., также контролируется путем фосфорилирования и дефосфорилирования, осуществляемого специфическими ферментами - протеинкиназой и протеинфосфатазой, активность которых в свою очередь регулируется гормонами. Уровень активности ключевых ферментов обмена углеводов и соответственно интенсивность и направленность самих про­цессов обмена определяются соотношением фосфорилированных и дефосфорилированных форм этих ферментов. Различают обратимую ковалентную и нековалентную хими­ческие модификации ферментов, осуществляемые через ОН-группы серина, реже тирозина или за счет нековалентных взаимодействий с молекулой фермента. В первом случае активным ферментом оказывается или фосфорилированная, или дефосфорилированная форма, как в случае с моле­кулами мышечной фосфорилазы и гликогенсинтазы соответственно. Пример. Рi- неорганический фосфат (Н3РО4), PPi- неорганический пирофосфат (Н4Р2О7), АМФ- остаток адениловой кислоты. * 2. Аллостерическая регуляция. Во многих строго биосинтетических реак­циях основным типом регуляции скорости многоступенчатого фермента­тивного процесса является ингибирование по принципу обратной связи. Это означает, что конечный продукт биосинтетической цепи подав­ляет активность фермента, катализирующего первую стадию синтеза, которая является ключевой для данной цепи реакции. Поскольку конечный продукт структурно отличается от субстрата, он связывается с аллостерическим (некаталитическим) центром молекулы фермента, вызывая ингиби­рование всей цепи синтетической реакции. Каждая стадия которого катализируется собст­венным ферментом:* Скорость подобной суммарной последовательности реакций в значи­тельной степени определяется концентрацией конечного продукта Р, накопление которого выше допустимого уровня оказывает мощное ингибирующее действие на первую стадию процесса и соответственно на фермент E1. Существование подобного механизма контроля активности ферментов метаболитами было обнаружено у Е. coli при исследовании синтеза изолейцина и ЦТФ. Изолейцин, являющийся конечным продуктом синтеза, избирательно подавляет активность треониндегидратазы. * Этот тип ингибирования получил название ингибирования по принципу обратной связи, или ретроингибирования.

25. Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации фермента, субстрата.

Одним из наиболее существенных факторов, определяющих скорость ферментатив­ной реакции, является концентрация субстрата (или субстратов) и продукта (продуктов). При постоянной концентрации фермента скорость реакции постепенно увеличивается, достигая определенного максимума, когда дальнейшее увеличение количества субстрата практически не оказывает влияния на скорость ферментативной реакции. Субстрат находится в избытке, а фермент полностью насыщен, т. е. все молекулы фермента связаны с субстратом. Ограничивающим скорость реакции фактором в последнем случае становится концентрация фермента. Именно при этих условиях определяют величину максимальной скорости (Vm ) и значения константы Михаэлиса. Из уравнения Михаэлиса-Ментен следует, что при высокой концент­рации субстрата и низком значении Ks скорость реакции является макси­мальной, т.е. v = Vmax. При низкой концентрации субстрата, напротив, скорость реакции оказывается про­порциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка). Следует указать, что уравнение Михаэлиса-Ментен в его классическом виде не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса про­дуктов реакции, например в реакции*. Скорость любой ферментативной реакции непосредственно зависит от концентрации фермента. Существующая линейная зависимость между этими величинами, когда скорость реакции прямо пропорциональна количеству присутствующего фермента, справедлива только в определен­ных условиях, например в начальный период ферментативной реакции, так как в этот период практически не происходит обратной реакции, а концент­рация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции v) будет пропорциональна концентрации фермента. Фермент является одной из реагирующих молекул в химической реакции и при взаимодействии с субстратом образует промежуточный фермент-субстратный комплекс, который далее подвергается распаду на продукт и свободный фермент:* Если упростить это уравнение, исключив промежуточный ES-комплекс:*, то в уравнениях для скоростей прямой и обратной реакций обязательным компонентом является концентрация фермента: * Однако в уравнениях для константы равновесия (Keq или Кр) концент­рация фермента уже не имеет значения: * Как видно, константа равновесия (Кр) ферментативной реакции не зависит от концентрации фермента. Определяя скорость и направление химической реакции, фермент тем не менее не оказывает влияния на Конечные (равновесные) концентрации реагирующих молекул и продуктов, определяющих величину константы равновесия.