7. Ватные пробки (объяснить, почему желательно именно ватные)

8. Ванночки для работы. В них обычно лежит пинцет, лезвие, крючки, иглы, салфетки, карандаш по стеклу, фильтровальная бумага и т.д.

Параграф 2. Световой микроскоп

Это микроскопы, основанные на использовании световых электромагнитных волн. Стоит сказать о том, что величина рассматриваемого объекта не может превышать 0,2 – 0,3 мкм, иначе световая волна будет дифрагировать через объект.

Любой световой микроскоп состоит из трёх частей: оптический, механической, осветительной.

К оптической составляющей относятся объективы, которые состоят из фронтальной (нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных линз, исправляющих недостатки оптического изображения.

Объективы подразделяют на сухие и иммерсионные (от лат. immersio - погружать). У жидкости показатель преломления света сродни показателю преломления стекла, свет не искажается в воздухе, поэтому при использовании подходящей жидкости можно добиться более чёткого изображения на больших увеличениях.

Если на объективе есть каёмка, то в зависимости от цвета и обозначения предполагается какое-то дополнительное свойство. Если на объективе белая каёмка, значит объектив иммерсионный водный. Если чёрная или есть аббревиатуры МИ, ОИ – объектив иммерсионный масляный.

Мы ещё поговорим об этом, когда закончим разговор про оптическую часть.

Другим прибором оптической части является окуляр. Это линза, формирующая изображение, непосредственно через которую смотрит наблюдатель. Хотя во многих современных микроскопах вместо него, или вместе с ним используется видеонасадка с ПЗС-матрицей, которая используется в наших телефонах и фотоаппаратах, но не будем об этом.

К механической части относятся тубус, конденсор, головка микроскопа, предметный стол, тубусодержатель с внутренними механизмами регулировки.

Конденсор (от лат. condense — сгущаю, уплотняю) - оптическое устройство для корректировки освещённости рассматриваемого предмета. Конденсор на обычном микроскопе расположен снизу от изучаемого объекта. Но есть особые микроскопы – возвратные, где свет поступает не снизу, а сверху объекта, тогда конденсор расположен также сверху. Часто на конденсоре расположены светофильтры и собирающие линзы, как пользоваться ими, мы разберём на практике.

В тубусе помещаются линзы оптической части. Тубус примыкает к головке микроскопа, на которой расположен барабан со сменными объективами. В самой головке могут располагаться призмы.

Предметный стол в современных микроскопах представляет собой сложную конструкцию. Перемещения предметного стола регулируются при помощи двух винтов: макровинта (или кремальеры) и микровинта. Ими несложно пользоваться, общие принципы работы я объясню подробнее на практике.

К осветительной части относятся линзы и осветительные приборы. Как мы увидим позднее, осветительные приборы – не только лампы накаливания. Это могут быть ртутные лампы, испускающие ультрафиолет, лампы с заданной длиной волны и проч.

Светопольная микроскопия

Это микроскопия прямого света. Преображение света в конденсоре ограничивается собиранием или рассеиванием светового пучка, который проходит через светофильтры, через объект исследования и попадает на окуляр. Наверняка хоть раз в жизни всем приходилось сталкиваться с подобной вещью.

Этот способ позволяет микроскопировать объекты величиной 0,2 – 0,5 мкм, то есть 200 – 500 нм, то есть 2000 – 5000 ангстрем. Частным случаем является ультрафиолетовая световая микроскопия (объекты до 0,1 мкм).

Темнопольная микроскопия

Бесцветные биологические образцы, подобные бактериям или живым клеточным культурам, иногда трудно увидеть при светопольной микроскопии из-за их прозрачности.

Есть два типа темнопольных конденсоров – кардиоид и параболоид. Их вы можете видеть на слайде. Их функция – рассеивание светового пучка таким образом, чтобы через препарат проходили только косые лучи и, преломляясь, попадали на объектив. Здесь в объектив попадают только дифрагирующие и рассеянные лучи, которые важны для процедуры отображения. Объекты выглядят светящимися на тёмном фоне.

При темнопольной микроскопии достигается видимость цветных структур, превосходящая таковую у обычного микроскопа. Это позволяет различать у объекта более тонкие структуры, придаёт им контраст на тёмном фоне.

Фазово-контрастная микроскопия

ФК-метод идеален для изучения бесцветных объектов. Проходя через тела с разным коэффициентом преломления и толщиной, световая волна изменяет свою фазу. Человеческий глаз не может заметить этого фазового отличия.

ФК претворяется в жизнь при помощи оптических модуляторов, представляющих собой кольцевую фазовую диафрагму и фазовое кольцо, малейшее изменение в плотности вещества становится видимым через перевод фазовых сдвигов волны в амплитудные. Создаётся оптический канал, через который могут пройти лучи только определённой фазы.

Изображение может быть позитивным (тёмные объекты на светлом фоне) и негативным (наоборот), самое важное – оно получается чрезвычайно контрастным.

Регулируя этот механизм, можно по совокупности промежуточных изображений получить полное представление о внутренней структуре объекта.

Метод дифференционной окраски (DIC)

Основан на том же эффекте, что и метод фазового контраста.

Свет линейно поляризуется специальной заслонкой (поляризатором), и разделяется в призме на два потока. Эти потоки пронизывают две близкорасположенные части образца.

С ними происходят различные сдвиги по фазе, преломления и проч., и в ту же секунду оба луча соединяются двойной линзой и после прохождения через анализаторный светофильтр, и вновь пропускаются через поляризатор. Изображение видится в различных оттенках серого. Чтобы уловить разницу между отдельными оттенками используется компенсатор, который суммирует видимые и невидимые эффекты, и строит цветную картинку.

Поляризационная микроскопия

Этот метод очень сложен для понимания людям, незнакомым с оптическими процессами в физике, но я попробую объяснить.

Он используется для образцов, которые способны изменять полярность световой волны. Такие образцы обладают т.н. двойным лучепреломлением. Примеры – кристаллы, полезные ископаемые, полимеры. Если такие структуры есть в живых тканях, они становятся отчётливо видны как светящиеся, в то время как их окружение остаётся тёмным.

Основан этот эффект на использовании двух поляризаторов, один находится над объектом, другой под ним. Они пропускают свет только с определённой полярностью. Этот свет проходит через объект, и, если там ничего нет, то при повороте поляризаторов относительно друг друга наблюдаются четыре отчётливые фазы угасания и высвечивания изображения, напоминающие угасание ламп в кинотеатре перед началом демонстрации фильма.

Если есть вещества с двойным лучепреломлением, то их фазы угасания и высвечивания будут смещены относительно всего изображения, мы будем получать то чёрные точки на светлом фоне, то белые точки на тёмном фоне. Это случается потому, что лучи, преломляясь, изменяют своё положение в пространстве, и их поляризация тоже меняется. Также в результате интерференции картинка может под разными углами менять цвета от серого, белого до жёлтого, красного и синего цветов, в зависимости от степени преломления объекта.

Люминесцентная микроскопия

Основана на явлении фотолюминесценции.

Первичная (собственная) люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания объектов, вторичная (наведённая) возникает после окраски препарата флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможность исследования живых организмов и обнаружение их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой контрастности.

Также достаточно популярным способом является инициирование флюоресценции. При облучении объекта УФ-лучами некоторое время можно наблюдать эффект поглощения-испускания света. Сущность его такова: объект забирает себе часть энергии высокочастотной волны при поглощении, и излучает обратно волну с более низкими частотами колебания. УФ лучи сами по себе невидимы, но излучение отраженного света становится видимым. Для работы с УФ лучами требуется противорадиационный щиток.