Параграф 1. Изготовление и изучение микробиологических препаратов

Основными являются световой и электронный микроскопы. Среди световых микроскопов существует множество модификаций, и различных отличающихся друг от друга техник работы. Они рассчитаны на работу с разными объектами, живыми, фиксированными или кристаллическими.

Но чтобы рассмотреть объект, необходимо его приготовить. К приготовлению объекта относятся процедуры, обеспечивающие возможность его изучения.

Препараты бывают разные, гистологические, микробиологические, геологические (шлифы) и т.д. По характеру взятого материала различают следующие виды:

• Срезы; забирают кусочек ткани, опускают в фиксатор (спирт 70%, формалин, смесь Корнуа или Никифорова и др.), обезвоживают восходящими концентрациями спиртов, уплотняют парафином или целлоидином и режут на микротоме.

• Микросрезы (ткани, 1-15 мкм); делаются на специальном устройстве – ультрамикротоме. Как уплотнители используют эпоксидные смолы, фиксируют обычно глютаровым альдегидом.

• Мазки (крови, костного мозга);

• Отпечатки (напр., селезёнки);

• Плёнки (брюшина, мягкая мозговая оболочка, бактериальные плёнки) (тотальные препараты).

По живости препараты подразделяют на витальные (сделанные для прижизненного наблюдения) и суправитальные (сделанные для изучения, демонстрации и других целей, где живые организмы не требуются).

Пункт 1.1. Изготовление препаратов живых клеток микроорганизмов:

1. Препарат «раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю воды и помещают в неё небольшое количество изучаемых микроорганизмов, перемешивают и накрывают покровным стеклом. Важно, капля должна быть настолько мала, что при её раздавливании не должно быть избытка жидкости, выступающего за покровное стекло. В противном случае избыток удаляется фильтровальной бумагой.

2. Препарат «висячая капля». Каплю суспензии наносят на покровное стекло, которое переворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением. Микроорганизмы оказываются загерметизированы. Если у них есть питательная среда, это даёт возможность долго за ними наблюдать.

3. Препарат «отпечаток». Из газона с микроорганизмами вырезают кубик. Его прикладывают к предметному стеклу колонией вверх, слегка прижимают сверху покровным стеклом, и убирают. На это предметное стекло капают воды, метиленового синего или других красителей, и опускают в эту каплю покровное стекло с отпечатком культуры.

4. Препарат «микрокультура» или «агаровая плёнка». На предметное стекло наносят немного горячей агаровой среды, распределяют её по всей поверхности стекла. После застывания весь этот агар соскребают, оставляя только два участка, по площади равных покровным стёклам, и наблюдают за ростом бактерий.

Пункт 1.2. Изготовление фиксированных препаратов микроорганизмов:

1. Приготовление мазка. Примечание: мазок должен быть так тонок, что в процессе приготовления высыхал.

2. Высушивание мазка. Если примечание пункта 1 соблюдено, то всё нормально. Если же этого недостаточно, нагреваем в потоке тёплого воздуха от горелки. Эту операцию необходимо проводить осторожно, иначе клетки деформируются.

3. Фиксация препарата. Преследует несколько целей: 1) убить микроорганизмы, 2) обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу и 3) сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мёртвые клетки окрашиваются лучше живых. Основные способы фиксации – физический и химический.

При физическом методе препарат держат над пламенем горелки до полного высушивания. Но не до сгорания. При приложении предметного стекла к тыльной стороне ладони должно возникать ощущение тепла, а не жжения. При этом бактериальные клетки могут сильно деформироваться.

Химическая фиксация – более щадящая, мазок погружают в фиксатор на определённое время, или капают фиксатор на мазок. В качестве фиксаторов используют чистый этанол, ацетон, смесь Никифорова (этанол + серный эфир 1:1), метанол, формалин.

Пункт 1.3. Окрашивание

Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями.

Различают кислые и основные красители. К кислым относятся те, у которых главный ион, придающий окраску (хроматофор) – анион. Логично, что такие красители будут иметь сродство к тем частям клетки, которые заряжены положительно, например, белковые компоненты цитоплазмы. Примерами кислых (базофильных) красителей являются эозин, эритрозин, кислый фуксин.

Основные красители имеют хромотофором катион, поэтому окрашивают части клетки, имеющие кислую реакцию – ДНК, РНК, содержимое лизосом и эндосом, и т.д. Примерами ацидофильных являются метиленовый синий, основной фуксин, генциан виолет, кристаллический фиолетовый, гемотоксилин, азур 2. Чаще на практике применяются именно основные красители.

Цитохимические красители – действие основано на проведении реакции между красителем и определённым химическим соединением (с определённой группой химических соединений). Например, жирорастворимые краски судан 3, судан 4, которые окрашивают только жировые включения. Реакция Фёльгена, в результате которой окрашиваются только нуклеиновые кислоты.

По типу окрашиваний и назначению выделяют:

1. Простая окраска – используется один краситель. Прокрашивается вся клетка, становятся видны её форма и размеры.

2. Сложная окраска. На мазок воздействуют комбинацией красителей разной природы. При этом один краситель будет являться основным, а другие – дополнительными. Кроме красящих веществ при сложных методах окраски применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Самым распространённым способом является окраска по Граму. Окрашивание связано с тем, что микроорганизмы имеют схожее, но неодинаковое строение клеточной стенки, в связи с чем у них наблюдается разная чувствительность к некоторым веществам.

Микробы, входящие в группу грамположительных (стафилококки, стрептококки) дают прочные соединения с йодом и трифенилметановыми красителями (метиленовым синим, генциан виолетом, кристаллическим фиолетовым). Они окрашиваются в ярко-фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы (гонококки, минингококки, возбудители кишечных заболеваний) такого окрашивания не дают, но при окрашивании фуксинон приобретают цвет от ярко-розового до красного.

Суправитальное окрашивание. Фиксированный препарат помещают на параллельные рейки, лежащие над кюветой, и заливают красителем на 1-2 мин. Нужно следить за тем, чтобы раствор красителя на препарате не подсыхал. В случае чего на мазок наливают новые порции красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой. Иммерсионное масло, если мазок фиксирован, можно капать сверху без покровного стекла.

Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, заранее покрытый фильтровальной бумагой. В правильно окрашенном препарате поле остаётся идеально светлым. Окрашиваются только клетки нужных или имеющихся организмов.

Витальное окрашивание. Для наблюдения микроорганизмов в нативном состоянии (особенно подвижных, например, спирохеты, микробы зубного налёта) используют негативные методы окраски. К ним относится метод Бурри, основанный на применении веществ, не способных к адсорбированию микроорганизмами и создающих тёмный фон (мы будем использовать туш). Для рассмотрения витальных препаратов часто применяют темнопольную и фазово-контрастную микроскопию. К группе витальных красителей можно отнести нейтральный красный, акридиновый оранжевый, метиленовый синий, эозины.

Если мы имеет дело с ультратонкими срезами, вирусными частицами, другими предметами, которые нужно изучать под электронным микроскопом, то мы не окрашиваем их. Мы их контрастируем – напыляем тяжелыми металлами (Pt, Pb, Au).