22.4 Біосинтез та деградація нуклеотидів

У розділі 8 ми наголошували, що нуклеотиди відіграють важливу роль у різноманітних процесах, які відбуваються в усіх клітинах. Вони є попередниками у синтезі ДНК та РНК, головними переносниками енергії хімічних зв’язків (що є основною функцією АТР, і деякою мірою - GTP), компонентами кофакторів NAD, FAD, S-аденозилметіоніну, коензиму А, складовими активованих біосинтетичних проміжних метаболітів, таких як UDP-глюкоза або CDP-діацилгліцерол. Деякі з нуклеотидів, зокрема, cAMP та cGMP, виконують роль вторинних клітинних месенджерів.

Існують два типи метаболічних шляхів утворення нуклеотидів: шляхи синтезу de novo та шляхи реутилізації. Синтез нуклеотидів de novo розпочинається з їхніх метаболічних попередників: амінокислот, рибозо-5-фосфату, СО₂ та NH₃. Шлях реутилізації – це шлях повторного використання вільних основ і нуклеозидів, що утворюються внаслідок розщеплення нуклеїнових кислот. Обидва типи шляхів відіграють важливу роль у клітинному метаболізмі і будуть розглянуті в цьому розділі.

Шляхи синтезу de novo пуринів та піримідинів, як виявилось, майже ідентичні в усіх живих організмів. Важливо відмітити, що вільні основи гуанін, аденін, тимін, цитозин та урацил не є проміжними продуктами шляхів синтезу de novo, хоча можна було б очікувати, що спочатку відбувається синтез цих основ, а потім їх приєднання до рибози. Побудова структури пуринового кільця відбувається поступово, шляхом послідовного приєднання одного або декількох атомів до попередника, який весь час залишається зв’язаним із рибозою. Піримідинове кільце утворюється у вигляді оротату, який приєднується до рибозофосфату і далі перетворюється у піримідинові нуклеотиди, необхідні для синтезу нуклеїнових кислот. На шляхах синтезу de novo вільні основи не функціонують у якості проміжних продуктів, проте на деяких шляхах реутилізації вони таку роль виконують.

Декілька важливих попередників є спільними для шляхів синтезу de novo як піримідинів, так і пуринів. Наприклад, обов’язковим учасником реакцій синтезу основ обох типів є фосфорибозилпірофосфат (ФРПФ), окрім того, у складі нуклеотидів зберігається структура рибози, що не характерно для описаних раніше шляхів біосинтезу триптофану та гістидину. Роль іншого важливого попередника на шляхах синтезу основ кожного типу відіграють амінокислоти: гліцин використовується для синтезу пуринів, аспартат – для синтезу піримідинів. Найважливішим джерелом аміногруп знову виступає глутамін – ця амінокислота бере участь у реакціях на п’яти різних етапах синтезу нуклеотидів de novo. На двох етапах синтезу пуринів як донор аміногруп використовується також аспартат.

Заслуговують на увагу ще дві особливості біосинтезу нуклеотидів. По-перше, отримано свідчення, особливо стосовно синтезу пуринів de novo, що ензими біосинтетичного шляху існують у клітині у вигляді великих мультиензимних комплексів; при обговоренні метаболізму ми постійно зустрічаємося з цією особливістю. По-друге, внутрішньоклітинні пули нуклеотидів (окрім АТР) відносно низькі, вони складають приблизно 1% або навіть менше від загальної кількості нуклеотидів, необхідної для синтезу клітинної ДНК. Це означає, що синтез нуклеотидів повинен тривати весь час, доки йде синтез нуклеїнових кислот, інакше саме синтез нуклеотидів буде лімітувати швидкість процесів реплікації та транскрипції ДНК. Оскільки ці процеси відіграють важливу роль у клітинах, що діляться, то у сучасній медицині ефективно використовуються препарати, які пригнічують синтез нуклеотидів.

У цьому розділі ми розглянемо послідовність та регуляцію біосинтетичних шляхів пуринів і піримідинів, утворення дезоксинуклеотидів, а також деградацію пуринів та піримідинів до сечової кислоти і сечовини. На завершення охарактеризуємо деякі хіміотерапевтичні засоби, що впливають на синтез нуклеотидів.

Синтез пуринових нуклеотидів de novo починається з фосфорибозилпірофосфату

До складу нуклеїнових кислот входить два основних пуринових нуклеотиди –аденозин-5’-монофосфат (АМР; аденілат) та гуанозин-5’-монофосфат (GMP; гуанілат), які містять пуринові основи аденін та гуанін відповідно. На рис. 22-32 показано походження атомів вуглецю та азоту пуринового кільця, встановлене Джоном Б’юкененом у експериментах на птахах із застосуванням ізотопної мітки. Детально шлях біосинтезу пуринів дослідили Д. Б’юкенен та Дж. Роберт Грінберг у 1950-х роках.

На першому етапі шляху аміногрупа, донором якої є глутамін, приєднується до атома С-1 ФРПФ (Рис. 22-33). Утворений 5-фосфорибозиламін - дуже нестійка сполука з періодом напіврозпаду при рН 7.5 близько 30 с. На основі цієї структури послідовно збирається пуринове кільце. Описаний далі шлях однаковий для всіх організмів, за винятком одного етапу у вищих еукаріотів, що буде відмічено окремо.

Джон Б’юкенен (фото)

На другому етапі синтезу пуринів відбувається приєднання трьох атомів зі складу гліцину (Рис. 22-33, етап ). Ця реакція конденсації протікає з використанням АТР, який необхідний для активації карбоксильної групи гліцину (утворення ацилфосфату). Далі приєднана аміногрупа гліцину формілюється за участю N¹⁰-формілтетрагідрофолату (етап ). Атом азоту надходить з глутаміну (етап ). Після дегідратації утворена структура замикається і утворюється п’ятичленне імідазольне кільце пуринового ядра у складі 5-аміноімідазол-рибонуклеотиду (АІР етап ).

На цьому етапі в утвореній структурі вже наявні три з шести атомів, необхідних для формування другого кільця пуринового ядра. Для завершення цього процесу на наступному етапі приєднується карбоксильна група (етап ). Ця реакція карбоксилювання є незвичною у тому сенсі, що не потребує наявності біотину, а натомість протікає з використанням бікарбонату, який міститься у водному середовищі. Потім відбувається перенесення карбоксильної групи від розміщеної поза циклом аміногрупи у положення 4 імідазольного кільця (етап ). Етапи  і  виявлено лише у бактерій та грибів. У вищих еукаріотів, у тому числі і у людини, продукт етапу  – 5-аміноімідазол-рибонуклеотид карбоксилюється безпосередньо до карбоксиаміноімідазол-рибонуклеотиду впродовж одного, а не двох етапів (реакція 6а). Каталізує реакцію ензим 5-аміноімідазол-рибонуклеотидкарбоксилаза.

Далі аспартат віддає свою аміногрупу впродовж двох етапів ( та ): утворення амідного зв’язку супроводжується видаленням вуглецевого скелету аспартату (у формі фумарату). Нагадаємо, що аспартат відіграє аналогічну роль впродовж двох етапів циклу сечовини (див. Рис. 18-10). Останній вуглець надходить від N¹⁰-формілтетрагідрофолату (етап ), після чого структура замикається з утворенням другого кільця конденсованого гетероциклу пуринового ядра (етап 11). На цьому шляху першою проміжною сполукою, яка містить завершене пуринове кільце, є інозинат (ІМР).

Виявилося, що необхідні для синтезу ІМР ензими, як і ензими біосинтезу триптофану та гістидину, всередині клітини організовані у великі мультиензимні комплекси. Доказом цього є існування окремих поліпептидів, які можуть одночасно виконувати декілька функцій, зокрема, каталізувати непослідовні етапи біосинтетичного шляху. У різних за ступенем еволюційного розвитку еукаріотичних організмів, таких як дріжджі, дрозофіла чи курчата, наведені на Рис. 22-33 етапи ,  та  каталізує один мультифункціональний протеїн. Інший мультифункціональний протеїн каталізує етапи  та 11. У людини один мультифункціональний ензим проявляє активність як 5-аміноімідазолкарбоксилази, так і N-сукциніл-5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотидсинтетази (етапи 6а та ). У бактеріальних клітинах ці ензиматичні активності властиві окремим протеїнам, проте у них також можуть існувати великі, нековалентно зв’язані комплекси. Можливо, що здійснюване такими комплексами „каналування” (або „ченелінг”, від англ. назви каналу - channel, тобто перенесення проміжних продуктів реакції від одного ензиму до іншого по внутрішньому каналу без їх дифузії у середовище – прим. ред.) відіграє особливо важливу роль у випадку утворення нестійких проміжних метаболітів, наприклад, 5-фосфорибозиламіну.

Для перетворення інозинату на аденілат необхідно ввести до складу інозинату аміногрупу, яка походить з аспартату (Рис. 22-34). Таке перенесення відбувається впродовж двох реакцій, подібних до етапів введення атому N-1 у пуринове кільце ( Рис. 22-33, етапи  та ). Основна відмінність полягає в тому, що джерелом високоенергетичного фосфату в синтезі аденілосукцинату виступає GTP, а не ATP. Гуанілат утворюється шляхом NAD⁺-залежного окиснення інозинату у положенні С-2 та подальшого приєднання аміногрупи, донором якої є глутамін. Остання реакція супроводжується розщепленням ATP до AMP та PP_i (Рис. 22-34).

Біосинтез пуринових нуклеотидів регулюється шляхом інгібування за типом зворотного зв’язку

Регуляція загальної швидкості синтезу de novo пуринових нуклеотидів та відносної швидкості утворення двох кінцевих продуктів - аденілату та гуанілату - здійснюється за участю трьох головних механізмів, що діють за типом зворотного зв’язку (Рис. 22-35). Перший з цих механізмів контролює початкову реакцію, характерну лише для шляху синтезу пуринів, а саме перенесення аміногрупи на ФРПФ з утворенням 5-фосфорибозиламіну. Цю реакцію каталізує алостеричний ензим глутамін-ФРПФ-амідотрансфераза, який інгібується кінцевими продуктами даної послідовності реакцій – IMP, AMP та GMP, при цьому AMP та GMP діють як синергісти. Тому кожного разу, коли AMP чи GMP накопичуються у надлишку, перший етап їх біосинтезу з ФРПФ частково пригнічується.

Другий регуляторний механізм діє на більш пізній стадії, у цьому випадку надлишок GMP у клітині інгібує процес утворення ксантилату з інозинату під дією ІМР-дегідрогенази, але не впливає на синтез АМР (Рис. 22-35). І навпаки, накопичення аденілату інгібує утворення аденілосукцинату ензимом аденілосукцинатсинтетазою, але не впливає на біосинтез GMP. Третій регуляторний механізм полягає у реципрокній регуляції підтримання рівноваги у синтезі двох рибонуклеотидів - АМР та GMP, зокрема GTP необхідний для перетворення ІМР на АМР (Рис. 22-34, етап ), тоді як АТР – для перетворення ІМР на GMP (етап ).

Завершальний механізм контролю полягає в інгібуванні синтезу ФРПФ шляхом алостеричної регуляції рибозофосфатпірофосфокінази. Активність цього ензиму інгібується не тільки під дією метаболітів інших біосинтетичних шляхів, для яких ФРПФ є вихідною сполукою, але також під дією ADP та GDP.

Піримідинові нуклеотиди синтезуються з аспартату, ФРПФ та карбамоїлфосфату

Поширені піримідинові рибонуклеотиди – це цитидин-5’-монофосфат (СМР, цитидилат) та уридин-5’-монофосфат (UMP, уридилат), які містять у своєму складі піримідинові основи – відповідно цитозин та урацил. Біосинтез піримідинових нуклеотидів de novo ( Рис. 22-36) дещо відрізняється від синтезу пуринових нуклеотидів; на шляху біосинтезу піримідинових нуклеотидів спочатку утворюється шестичленне піримідинове кільце, а потім до нього приєднується рибозо-5-фосфат. Для цього процесу необхідний карбамоїлфосфат, який виконує роль проміжного метаболіту також у циклі сечовини (Рис. 18-10). Однак, як ми зазначали у Розділі 18, карбамоїлфосфат, необхідний для синтезу сечовини у тварин, утворюється в мітохондріях під дією ензиму карбамоїлфосфатсинтетази І, тоді як карбамоїлфосфат, що використовується для біосинтезу піримідинів, утворюється у цитозолі під дією іншої форми ензиму – карбамоїлфосфатсинтетази ІІ. У бактерій за утворення необхідного для синтезу аргініну та піримідинів карбамоїлфосфату відповідає один і той же ензим. Бактеріальний ензим має три окремі активні центри, розташовані вздовж каналу завдовжки близько 100Å (Рис. 22-37). Бактеріальна карбамоїлфосфатсинтетаза є яскравим прикладом ензиму, який здійснює „каналування” нестабільних проміжних продуктів реакції від одного активного центру до іншого.

На першому, пусковому етапі біосинтезу піримідинів карбамоїлфосфат реагує з аспартатом з утворенням N-карбамоїласпартату (Рис. 22-36), каталізує реакцію ензим аспартаттранскарбамоїлаза. У бактерій цей етап біосинтезу піримідинів ефективно регулюється, а бактеріальна аспартаттранскарбамоїлаза є одним з найбільше досліджених алостеричних ензимів (див. нижче). Після того, як ензим дигідрооротаза видаляє молекулу води зі складу N- карбамоїласпартату, піримідинове кільце замикається і утворюється L-дигідрооротат. Ця сполука окиснюється з утворенням піримідинового похідного оротату, кінцевим акцептором електронів у реакції виступає NAD⁺. У еукаріотів перші три ензими цього біосинтетичного шляху - карбамоїлфосфатсинтетаза ІІ, аспартаттранскарбамоїлаза та дигідрооротаза - є складовими частинами одного трифункціонального протеїну, який скорочено позначають КАД. До його складу входять три ідентичні поліпептидні ланцюги (M_r кожного – 230000), кожен з яких містить активні центри для каталізу усіх трьох реакцій. Ймовірно, що функціонування великих, мультиензимних комплексів є типовим для даного біосинтетичного шляху.

Після синтезу оротату до нього приєднується бічний ланцюг рибозо-5-фосфату (донором якого знову виступає ФРПФ) і утворюється оротидилат (Рис. 22-36). Оротидилат піддається декарбоксилюванню з утворенням уридилату, який далі фосфорилюється і перетворюється на UTP. CTP утворюється з UTP у ході реакції, проміжним продуктом якої є ацилфосфат (на цьому етапі витрачається одна молекула ATP); каталізує цю реакцію ензим цитидилатсинтетаза. Донором атома азоту, як правило, виступає глутамін, хоча у багатьох видів організмів цитидилатсинтетази здатні безпосередньо використовувати NH₄ ⁺.

Біосинтез піримідинових нуклеотидів регулюється шляхом інгібування за типом зворотного зв’язку

Швидкість біосинтезу піримідинових нуклеотидів у бактерій регулюється переважно ензимом аспартаттранскарбамоїлазою (АТКазою), який каталізує першу з послідовних реакцій цього біосинтетичного шляху. АТКаза інгібується кінцевим продуктом послідовності реакцій – цитидинтрифосфатом (СТР) (Рис. 22-36). Молекула бактеріальної АТКази складається з шести каталітичних та шести регуляторних субодиниць (див. Рис. 6-27). Каталітичні субодиниці зв’язують молекули субстрату, а регуляторні – молекули алостеричного інгібітор СТР. Як уся молекула ензиму, так і її субодиниці, можуть існувати у двох конформаціях – активній та неактивній. Ензим проявляє максимальну активність, коли його регуляторні субодиниці вільні, тобто не зв’язані з СТР. Якщо ж СТР накопичується і зв’язується з регуляторними субодиницями, то їхня конформація змінюється. Такі зміни передаються каталітичним субодиницям, які набувають конформації, характерної для неактивного стану. АТР запобігає змінам, які спричиняє СТР. Рис. 22-38 ілюструє вплив алостеричних регуляторів на активність АТКази.

Нуклеозидмонофосфати перетворюються на нуклеозидтрифосфати

Нуклеотиди, що використовуються у біосинтетичних реакціях – це, як правило, нуклеозидтрифосфати. Шляхи їх утворення однакові в усіх клітинах. Фосфорилювання АМР з утворенням ADP здійснює аденілаткіназа у реакції:

ATP + AMP → 2 ADP -стрілки

Утворений ADP фосфорилюється під дією гліколітичних ензимів або в процесі окисного фосфорилювання з утворенням АТР.

Під дією ензимів нуклеозидмонофосфаткіназ з АТP утворюються інші нуклеозиддифосфати. Нуклеозидмонофосфаткінази, як правило, характеризуються специфічністю стосовно певних основ, але не проявляють специфічності щодо моносахаридного залишку (рибози чи дезоксирибози); вони каталізують реакцію:

ATP + NMP → ADP + NDP стрілки

Системи рефосфорилювання ADP в ATP, які ефективно діють у клітині, спрямовують цю реакцію у бік утворення продуктів.

Нуклеозиддифосфати перетворюються на нуклеозидтрифосфати під дією поширеного ензиму нуклеозиддифосфаткінази, який каталізує реакцію

NTP_D + NDP_A → NDP_D + NTP_A

Цей ензим цікавий тим, що не проявляє специфічності ні до основи (пурину чи піримідину), ні до моносахаридного залишку (рибози чи дезоксирибози), ні до акцептора (А) чи донора (D) фосфатної групи, хоча донором (NTP_D )майже завжди виступає АТР, оскільки за аеробних умов він наявний у клітині у значно вищих концентраціях, ніж інші нуклеозидтрифосфати.

Рибонуклеотиди є попередниками дезоксирибонуклеотидів

Будівельні блоки ДНК - дезоксирибонуклеотиди - утворюються з відповідних рибонуклеотидів шляхом прямого відновлення атома вуглецю у положенні 2’ D-рибози з утворенням 2’-дезоксипохідного. Таким шляхом, наприклад, аденозиндифосфат (ADP) відновлюється до 2’-дезоксиаденозиндифосфату (dADP), а GDP – до dGDP. Ця реакція є дещо незвичною, оскільки відновлюється неактивований атом вуглецю; прикладу аналогічної реакції немає серед інших хімічних реакцій. Каталізує реакцію ензим рибонуклеотидредуктаза, детально вивчений у E. coli, де його субстратами є рибонуклеозиддифосфати.

Для відновлення D-рибозної частини молекули рибонуклеозиддифосфату до 2’-дезокси-D-рибози потрібні два атоми водню, які зрештою надходять від NADРH, але у їх передачі, як проміжний переносник водню, бере участь особливий протеїн – тіоредоксин. Цей поширений протеїн виконує відновлювальну функцію також у фотосинтезі (див. Рис. 20-19) та у інших процесах. У молекулі тіоредоксину наявні дві -SH-групи, за допомогою яких і здійснюється перенесення атомів водню від NADPH до рибонуклеозиддифосфату. Окиснена (дисульфідна) форма тіоредоксину відновлюється за допомогою NADPH у реакції, яку каталізує тіоредоксинредуктаза (Рис. 22-39). Відновлений тіоредоксин далі використовується рибонуклеотидредуктазою для відновлення нуклеозиддифосфатів (NDP) до дезоксирибонуклеозиддифосфатів (dNDP). Іншим джерелом відновлювальних еквівалентів для рибонуклеотидредуктази є глутатіон (GSH). Він виступає у ролі агента, що відновлює подібний до тіоредоксину протеїн глутаредоксин. Цей протеїн передає відновлювальні еквіваленти від глутатіону на рибонуклетидредуктазу (Рис. 22-39).

Механізм рибонуклеотидредуктазної реакції заслуговує на особливу увагу як найбільш повно досліджений приклад залучення вільних радикалів у процес біохімічної трансформації, що раніше вважалось нетиповим для біологічних систем. Рибонуклеотидредуктаза E. coli та більшості еукаріотичних клітин є димером, що складається з субодиниць, які позначають як R1 та R2 (Рис. 22-40). Субодиниця R1 містить регуляторні центри двох типів, які будуть описані нижче. Два активні центри ензиму розміщені на межі розділу субодиниць R1 та R2. Субодиниця R1 постачає дві сульфгідрильні групи, необхідні для прояву активності кожного з активних центрів, а субодиниця R2 постачає стабільний тирозильний радикал. Окрім того, субодиниця R2 містить кофактор з двома атомами заліза (Fe³⁺), який сприяє утворенню та стабілізації тирозильного радикалу (Рис. 22-40). Тирозильний радикал надто віддалений від активного центру, щоб взаємодіяти з ним безпосередньо, але він ініціює утворення у активному центрі іншого радикалу, який бере участь у каталізі.

Вірогідний механізм рибонуклеотидредуктазної реакції наведено на рис. 22-41. Утворенння 3’-рибонуклеотидного радикалу на етапі  сприяє стабілізації катіону, що утворюється в С-2’-положенні після того, як втрачається молекула Н₂О (етапи  та ). Відновлення радикал-катіону відбувається внаслідок двох послідовних перенесень електрона, що супроводжується окисненням дитіолової групи (етап ). На етапі , який є зворотним до етапу , відбувається регенерація радикалу у активному центрі (тирозильного радикалу) та утворення дезоксипродукту. Окиснений дитіол відновлюється і цикл завершується (етап ). Як вказано вище, у клітинах Е. coli джерелами відновлювальних еквівалентів, необхідних для протікання рибонуклеотидредуктазної реакції, може бути тіоредоксин і глутаредоксин.

Відомо чотири класи рибонуклеотидредуктаз. Механізм їх дії (де він встановлений) загалом відповідає схемі, наведеній на Рис. 22-41, але ензими розрізняються за природою груп, які забезпечують утворення радикалу у активному центрі, та за кофакторами, необхідними для цього процесу. Ензим Е. coli (клас І) потребує наявності кисню для регенерації тирозильного радикалу і тому функціонує лише у аеробному середовищі. Ензими класу ІІ, виявлені у деяких інших мікроорганізмах, замість двохатомного залізовмісного центру містять 5’-дезоксиаденозилкобаламін (Див. додаток 17-2). Ензими класу ІІІ еволюційно пристосовані для функціонування у анаеробному середовищі. У клітинах Е.coli в анаеробних умовах виявляється активність окремої рибонуклеотидредуктази класу ІІІ; цей ензим містить залізо-сірковий кластер (який за структурою відмінний від двохатомного залізовмісного центру ензимів класу І) і для прояву активності потребує NADPH та S-аденозилметіоніну. У якості субстратів він використовує переважно нуклеозидтрифосфати, а не нуклеозиддифосфати. У деяких мікроорганізмів виявлено рибонуклеотидредуктазу класу ІV, яка містить двохатомний марганецьвмісний центр. Виникнення різних класів рибонуклеотидредуктаз, які забезпечують синтез попередників ДНК за різних умов середовища, свідчить про важливу роль цієї реакції у метаболізмі нуклеотидів.

Регуляція активності рибонуклеотидредуктази у Е.coli має ще одну особливість – шляхом зв’язування ефекторних молекул регулюється не лише активність ензиму, але і його субстратна специфічність. Кожна R1-субодиниця містить регуляторні центри двох типів (Рис. 22-40). Через центри першого типу регулюється загальна ензиматична активність, тут зв’язується або АТР ( тоді ензим активується), або dATP ( тоді ензим інактивується). Через центри другого типу регулюється субстратна специфічність залежно від зв’язаної ефекторної молекули - ATP, dATP, dTTP або dGTP (Рис. 22-42). Зв’язування ATP чи dATP приводить до відновлення переважно UDP та CDP. Якщо ж зв’язується dTTP або dGTP, відповідно стимулюється відновлення GDP або ADP. Така схема регуляції забезпечує існування збалансованого пулу попередників для синтезу ДНК. АТР виступає також у ролі загального активатора процесів біосинтезу та відновлення рибонуклеотидів. У разі наявності низьких концентрацій dATP швидкість відновлення піримідинових нуклеотидів прискорюється. У випадку підвищення вмісту dTTP, яке свідчить про надлишкове утворення піримідинових dNTP, відбувається зміна специфічності і відновлюється переважно GDP. І навпаки, за підвищеного вмісту dGTP специфічність змінюється на користь відновлення ADP, а dATP у високих концентраціях пригнічує ензиматичну активність. Припускають, що ці ефектори переводять ензим у певні конформаційні стани, яким властива різна субстратна специфічність.

Тимідилат утворюється з dCDP та dUMP

До складу молекули ДНК входить тимін, а не урацил, тому у синтезі de novo тиміну беруть участь лише дезоксирибонуклеотиди. Безпосереднім попередником тимідилату (dTMP) є dUMP. У бактерій шлях біосинтезу dUMP починається з dUTP, який утворюється або внаслідок дезамінування dCTP, або внаслідок фосфорилювання dUDP (Рис. 22-43). Перетворення dUTP на dUMP каталізує ензим dUTPаза (дезоксиуридинтрифосфатаза). Ця реакція відіграє важливу роль у підтриманні пулу dUTP на низькому рівні та запобігає включенню уридилату у ДНК.

Перетворення dUMP на dTMP каталізує ензим тимідилатсинтаза. Одновуглецева одиниця, що відповідає ступеню окиснення гідроксиметильної групи (─СН₂ОН) (див. Рис. 18-17), переноситься від N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолату на dUMP і відновлюється до метильної групи ( Рис. 22-44). Відновлення відбувається за рахунок окиснення тетрагідрофолату до дигідрофолату, що загалом не характерне для реакцій, які протікають за участі тетрагідрофолату (механізм цієї реакції наведено на Рис. 22-50). Дигідрофолат знову відновлюється до тетрагідрофолату під дією ензиму дигідрофолатредуктази. Така регенерація тетрагідрофолату має важливе значення для протікання багатьох процесів, які потребують його наявності. У рослин та принаймні у одного виду найпростіших тимідилатсинтаза та дигідрофолатредуктаза входять до складу одного біфункціонального протеїну.

Внаслідок деградації пуринів та піримідинів утворюються відповідно сечова кислота та сечовина

Розпад пуринових нуклеотидів починається з відщеплення фосфатної групи під дією 5’-нуклеотидази ( Рис. 22-45). З аденілату у такий спосіб утворюється аденозин, який під дією аденозиндезамінази дезамінується, перетворюючись на інозин. Інозин зазнає гідролізу, внаслідок чого утворюються його пуринова основа гіпоксантин та D-рибоза. Гіпоксантин окиснюється спочатку до ксантину, а потім до сечової кислоти, каталізує ці реакції флавін-залежний ензим ксантиноксидаза, простетична група якої містить один атом молібдену та чотири залізосіркові центри. Акцептором електронів у цій складній реакції виступає молекулярний кисень.

Кінцевим продуктом катаболізму GMP також є сечова кислота. Спочатку відбувається гідроліз GMP з утворенням гуанозину, який розщеплюється до вільного гуаніну. Внаслідок гідролітичного відщеплення аміногрупи гуанін перетворюється на ксантин, з якого під дією ксантиноксидази утворюється сечова кислота ( Рис. 22-45).

У приматів, птахів та деяких інших тварин сечова кислота є кінцевим продуктом катаболізму пуринів, що виводиться з організму. У здорової дорослої людини загальна кількість сечової кислоти, що виводиться з сечею, складає приблизно 0,6 г на добу; вона утворюється частково внаслідок розщеплення пуринів, які надходять з їжею, а частково внаслідок обміну пуринових нуклеотидів у складі нуклеїнових кислот. Однак у більшості ссавців та інших хребетних сечова кислота піддається подальшому розщепленню до алантоїну під дією уратоксидази. Як видно з Рис. 22-45, у інших організмів шлях розпаду пуринових нуклеотидів ще довший.

Шляхи деградації піримідинів, як правило, ведуть до утворення NH₄⁺ і, отже, до синтезу сечовини. Наприклад, тимін розщеплюється до напівальдегіду метилмалонілу ( Рис. 22-46), який є проміжним продуктом катаболізму валіну. Надалі ця сполука розпадається, перетворюючись послідовно на пропіоніл-СоА, метилмалоніл-СоА та на сукциніл-СоА (див. Рис. 18-27).

(Медичний символ) У людини виявлено низку генетичних порушень метаболізму пуринів, які призводять до важких захворювань. Наприклад, дефіцит аденозиндезамінази (АДА) спричиняє розвиток важкої форми імунодефіциту, за якої порушується розвиток Т-лімфоцитів та В-лімфоцитів. При цьому всередині клітини у 100 разів зростає концентрація dATP, який є сильним інгібітором ензиму рибонуклеотидредуктази (Рис. 22-42). Підвищення рівня dATP призводить до загального виснаження пулів усіх dNTP у Т-лімфоцитах. Причина ураження В-лімфоцитів залишається менш зрозумілою. Хворі з дефіцитом аденозиндезамінази позбавлені імунного захисту і виживають лише за умови перебування у стерильному оточенні. Лікування недостатності аденозиндезамінази було одним з перших напрямків генної терапії людини (див. додаток 9-2)

Пуринові та піримідинові основи використовуються повторно шляхом реутилізації

Внаслідок метаболічної деградації нуклеотидів у клітинах постійно утворюються вільні пуринові та піримідинові основи. Значна частина пуринових основ не зазнає подальшого розщеплення, а реутилізується, тобто повторно використовується для синтезу пуринових нуклеотидів de novo, але набагато простішим шляхом, ніж описаний вище. Один із головних шляхів реутилізації складається лише з реакції, яку каталізує ензим аденозин-фосфорибозилтрансфераза. У ході цієї реакції вільний аденін взаємодіє з ФРПФ з утворенням аденінового нуклеотиду:

Аденін + ФРПФ → AMP + PP_i

Вільний гуанін та гіпоксантин (продукт дезамінування аденіну, Рис. 22-45) реутилізуються таким же шляхом за допомогою іншого ензиму – гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази. Подібні шляхи реутилізації піримідинових основ діють у мікроорганізмів та, можливо, у ссавців.

(Медичний символ) Відсутність активності ензиму гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази у зв’язку з генетичним дефектом, який зустрічається майже виключно у хлопчиків, призводить до прояву комплексу симптомів, що носять назву синдром Леша-Найгана. Діти з таким генетичним розладом, що проявляється приблизно у віці двох років, страждають на порушення координації рухів та розумову відсталість. Окрім того, вони надзвичайно агресивні і часто їх агресивність звернена на самих себе: вони можуть покалічити себе, кусаючи губи та пальці на руках і ногах.

Синдром Леша-Найгана свідчить про важливе значення шляхів реутилізації. Гіпоксантин та гуанін постійно утворюються у клітині внаслідок розщеплення нуклеїнових кислот. За відсутності гіпоксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази зростає рівень ФРПФ і, внаслідок посилення синтезу de novo, накопичується надмірна кількість пуринів. Це, в свою чергу, призводить до посиленого утворення сечової кислоти та подагроподібного ураження тканин (див. нижче). Особливо чутливим до порушення шляхів реутилізації є мозок, чим і можна пояснити ушкодження центральної нервової системи у дітей з синдромом Леша-Найгана. Розробка медодів лікування цієї хвороби, так само, як і імунодефіцитів, що виникають внаслідок відсутності аденозиндезамінази, належить до першочергових завдань генної терапії (див. додаток 9-2).

Надлишкове утворення сечової кислоти спричиняє подагру

(Медичний символ) Подагра, яку протягом тривалого часу помилково вважали “хворобою гурманів” – це хвороба суглобів, спричинена підвищеною концентрацією сечової кислоти у крові та тканинах. Напади артриту. що супроводжуються запаленням, гострим болем, почервонінням та припухлістю у ділянці суглобів, зумовлені надмірним відкладанням кристалів урату натрію. Вражаються також нирки, тому що надлишок сечової кислоти відкладається у ниркових канальцях. Хворіють на подагру переважно чоловіки. Справжня причина виникнення подагри невідома, але часто вона супроводжується недостатнім виведенням урату. У деяких випадках причиною може бути спадковий дефіцит якогось з ензимів метаболізму пуринів.

(Фото) Гертруда Еліон (1918 – 1999) та Джордж Гітчінгс (1905 – 1998)

Ефективним методом лікування подагри є поєднання відповідної дієти та лікувальної терапії. З раціону виключають продукти з високим вмістом нуклеотидів та нуклеїнових кислот, зокрема, печінку чи продукти із залоз, (а також каву і чай, які містять пурини кофеїн та теобромін – прим. ред.). Ефективним у лікуванні подагри є застосування алопуринолу (Рис. 22-47). Цей препарат є інгібітором ксантиноксидази – ензиму, що каталізує перетворення пуринів на сечову кислоту. Ксантиноксидаза використовує алопуринол у якості субстрата і перетворює його на оксипуринол (аллоксантин). Залишаючись міцно зв’язаним з активним центром оксипуринол інактивує відновлену форму ензиму. За умови пригнічення активності ксантиоксидази метаболізм пуринів завершується утворенням ксантину та гіпоксантину, які набагато краще розчинаються у воді, ніж сечова кислота, а тому не відкладаються у вигляді кристалів. Алопуринол розробили вчені Гертруда Еліон та Джордж Гітчінгс; вони запропонували також препарат ацикловір, який застосовується для лікування хворих на СНІД, та інші препарати, що є аналогами пуринових основ і використовуються у хіміотерапії ракових захворювань.

Мішенями дії багатьох хіміотерапевтичних препаратів є ензими, що функціонують на шляхах біосинтезу нуклеотидів

(Медичний символ) На відміну від клітин більшості нормальних тканин, ріст ракових клітин не піддається контролю. Ракові клітини ростуть набагато швидше і потребують більшої кількості нуклеотидів як попередників для синтезу ДНК та РНК, а тому вони набагато чутливіші, ніж нормальні клітини, до дії інгібіторів біосинтезу нуклеотидів. Для лікування раку та інших захворювань розроблено цілу низку ефективних хіміотерапевтичних препаратів, що діють як інгібітори одного або декількох ензимів, задіяних на шляхах біосинтезу нуклеотидів. Ми розглянемо декілька добре досліджених прикладів, які проілюструють ефективність таких методів лікування, а також допоможуть зрозуміти, як функціонують ці ензими.

До першої групи препаратів належать сполуки, які інгібують глутамінамідотрансферазу. Нагадаємо, що глутамін виконує роль донора азоту не менше ніж у половині реакцій біосинтезу нуклеотидів. Багато з цих ензимів дуже подібні як за будовою центрів зв’язування глутаміну, так і за механізмом вивільнення NH₄⁺. Активність більшості із них сильно інгібують аналоги глутаміну, наприклад, азасерин та ацивіцин (Рис. 22-48). Азасерин, досліджений Джоном Б’юкененом у 1950-х роках, був одним з перших представників групи інактиваторів ензимів, відібраних на основі знань про механізм їх дії (самовбивчі інактиватори, див. стр. та додаток 22-2). Отримано дані про те, що ацивіцин може бути використаний як протираковий хіміотерапевтичний препарат.

Іншими зручними мішенями для фармацевтичних препаратів слугують також ензими тимідилатсинтаза та дигідрофолатредуктаза, які забезпечують у клітині лише шлях синтезу тиміну (Рис. 22-49). Одним з ефективних хіміотерапевтичних агентів, що пригнічує активність тимідилатсинтази, є фторурацил, який сам по собі не інгібує активність ензиму. У клітині ця сполука залучається до шляху реутилізації піримідинових основ, перетворюючись на фтордезоксиуридинмонофосфат (FdUMP), а вже він зв’язується з ензимом та інактивує його. Інгібування тимідилатсинтази фтордезоскиуридинмонофосфатом (Рис. 22-50) є класичним прикладом спрямованої інактивації ензиму, що ґрунтується на розумінні механізму його дії. Іншим ефективним хіміотерапевтичним агентом є інгібітор дигідрофолатредуктази метотрексат. Цей аналог фолату діє як конкурентний інгібітор; спорідненість ензиму до метотрексату приблизно у 100 разів вища, ніж до дигідрофолату. Подібним до метотрексату за структурою і способом дії є препарат аміноптерин

Застосування у медицині інгібіторів біосинтезу нуклеотидів не обмежується лікуванням раку. Мішенями їх дії можуть бути будь-які клітини, що швидко ростуть (серед них – бактерії та найпростіші). Триметоприм, антибіотик, винайдений Гітчінгсом та Еліон, має в 100000 разів вищу спорідненість до дигідрофолатредуктази бактерій, ніж до ензиму ссавців. Його застосовують для лікування певних бактеріальних інфекцій сечової системи та середнього вуха. У паразитичних найпростіших, наприклад, у трипаносом, які викликають африканську сонну хворобу (африканська трипаносомія), відсутні шляхи біосинтезу нуклеотидів de novo, тому ці організми особливо чутливі до агентів, які впливають на шляхи реутилізації нуклеотидів, що поступають з навколишнього середовища. Алопуринол (Рис. 22-47) та інші подібні аналоги пурину можуть бути перспективними у лікуванні африканської трипаносомії і споріднених патологій. У додатку 22-2 описано ще один підхід з метою подолання африканської трипаносомії, розроблений на основі наших знань про метаболізм та механізм дії ензимів.

Підсумок 22.4 Біосинтез та деградація нуклеотидів

• Кільцева структура пуринів вибудовується поетапно, починаючи з 5-фосфорибозиламіну. Усі атоми азоту, які входять до складу пуринів, постачаються амінокислотами глутаміном, гліцином та аспартатом. Пуринове ядро утворюється впродовж двох етапів, на кожному з яких відбувається замикання окремого кільця.

• Піримідини синтезуються з карбамоїлфосфату та аспартату, потім відбувається приєднання рибозо-5-фосфату і утворення піримідинових рибонуклеотидів.

• Нуклеозидмонофосфати перетворюються на відповідні трифосфати у реакціях ензиматичного фосфорилювання. Рибонуклеотиди перетворюються на дезоксирибонуклеотиди під дією рибонуклеотидредуктази - ензиму, що характеризується нетиповими механізмом дії та способом регуляції. Тимінові нуклеотиди синтезуються з dCDP та dUMP.

• Кінцевими продуктами деградації пуринів та піримідинів є сечова кислота і сечовина.

• Вільні пурини зберігаються і повторно використовуються для побудови нуклеотидів. Генетично зумовлені дефекти певних ензимів, задіяних у реутилізації пуринових нуклеотидів, спричиняють важкі захворювання, зокрема синдром Леша-Найгана та АДА-дефіцит.

• Відкладання кристалів сечової кислоти у суглобах, причиною якого також може бути певний генетичний дефект, призводить до розвитку подагри.

• Ензими шляхів біосинтезу нуклеотидів є мішенню дії багатьох хіміотерапевтичних препаратів, які використовуються для лікування ракових та інших захворювань.

Основні терміни

Жирним шрифтом виділено терміни, значення яких наведено у словнику

цикл азоту

фіксація азоту 834

симбіонти 834

нітрогеназний комплекс 835

леггемоглобін 836

глутамінсинтаза 838

глутаматсинтаза 838

глутамінамідотрансфераза 840

5-фосфорибозил-1-пірофосфат (ФРПФ) 842

триптофансинтаза 849

порфірин 854

порфірії 854

білірубін 854

фосфокреатин 857

креатин 857

глутатіон (GSH) 857

ауксин 859

дофамін 859

норепінефрин 859

епінефрин 859

γ-амінобутират (ГАМК) 859

серотонін 859

гістамін 859

циметидин 869

спермін 860

спермідин 860

орнітиндекарбоксилаза 860

шлях de novo 862

шлях реутилізації 862

інозинат (IMP) 866

карбамоїлфосфатсинтетаза ІІ 868

аспартаттранскарбамоїлаза 868

нуклеозидмонофосфаткіназа 869

нуклеозиддифосфаткіназа 869

рибонуклеотидредуктаза 869

тіоредоксин 869

тимідилатсинтаза 873

дигідрофолатредуктаза 873

недостатність аденозиндезамінази 874

синдром Леша-Найгана 875

алопуринол 876

азасерин 876

ацивіцин 876

фторурацил 876

метотрексат 876

аміноптерин 876

Додаткова література

Фіксація азоту

Біосинтез амінокислот

Сполуки, що походять з амінокислот

Біосинтез нуклеотидів

Генетичні хвороби

Завдання

1. Споживання АТФ кореневими бульбочками бобових. Бактерії, що живуть у кореневих бульбочках рослин гороху, використовують понад 20% АТР, який утворюється рослиною. Назвіть причину, чому ці бактерії споживають так багато АТР.

2. Глутаматдегідрогеназа та синтез протеїнів. Бактерії Methylophilus methylotrophus здатні синтезувати протеїни з метанолу та амонію. За допомогою технології рекомбінантних ДНК у геном бактерій M. methylotrophus було введено ген глутаматдегідрогенази з E. coli, що призвело до підвищення кількості синтезованого протеїну. Чому?

3. Перетворення аспартату на аспарагін. Існує два шляхи перетворення аспартату на аспарагін з використанням енергії АТР. У багатьох бактерій наявний ензим аспарагінсинтетаза, який використовує іони амонію як джерело атомів азоту. Для аспарагінсинтетази ссавців, натомість, таким джерелом слугує глутамін. Поясніть, чому ссавці використовують саме такий шлях синтезу аспарагіну, хоча він потребує більшої кількості АТФ (для синтезу глутаміну).

4. Рівняння реакції синтезу аспартату з глюкози. Напишіть сумарне рівняння реакції синтезу аспартату (замінної амінокислоти) з глюкози, діоксиду вуглецю та амонію.

5. Особливості дієти у випадку дефіциту фенілаланінгідроксилази. Тирозин належить до замінних амінокислот, однак особи з генетичним дефектом ензиму фенілаланінгідроксилази для нормального росту повинні отримувати тирозин з їжею. Поясніть, чому.

6. Кофактори в реакціях переносу одновуглецевих груп. Більшість реакцій переносу одновуглецевих груп протікають за участі одного з трьох кофакторів: біотину, тетрагідрофолату або S-аденозилметіоніну (Розділ 18). Як правило, в якості донора метильних груп використовується S-аденозилметіонін, оскільки потенціал перенесення метильних груп N⁵-метилтетрагідрофолату недостатній для протікання більшості біосинтетичних реакцій. Однак у випадку утворення метіоніну у реакції, що каталізується метіонінсинтазою, донором метильних груп виступає саме N⁵-метилтетрагідрофолат (етап  на рис. 22-15); метіонін є безпосереднім попередником S-аденозилметіоніну (див. Рис. 18-18). Поясніть, чому метильна група S-аденозилметіоніну походить саме з N⁵-метилтетрагідрофолату, хоча потенціал перенесення метильної групи для N⁵-метилтетрагідрофолату складає лише одну тисячну від такого для S-аденозилметіоніну.

7. Узгоджена регуляція біосинтезу амінокислот. Активність глутамінсинтетази E. coli незалежно модулюється різними продуктами метаболізму глутаміну (див. Рис. 22-6). У разі такого узгодженого інгібування, ступінь пригнічення активності ензиму вищий, ніж проста сума ефектів окремих продуктів. У чому полягає перевага узгодженого інгібування активності ензиму у випадку, якщо E. coli росте на середовищі, збагаченому на гістидин?

8. (Медичний символ) Взаємозв’язок між дефіцитом фолієвої кислоти та анемією. Дефіцит фолієвої кислоти, яку вважають найбільш поширеним проявом гіповітомінозів, спричиняє тип анемії, за якої порушується синтез гемоглобіну та дозрівання еритроцитів. Поясніть метаболічний взаємозв’язок між синтезом гемоглобіну та дефіцитом фолієвої кислоти?

9. Біосинтез нуклеотидів у бактерій, позбавлених здатності синтезувати певні амінокислоти.

Нормальні клітини E. coli синтезують усі 20 амінокислот, однак деякі мутанти, які називають амінокислотними ауксотрофами (словник Дорланда пише авксотрофний?), нездатні до синтезу певних амінокислот і для оптимального росту потребують додавання їх до культурального середовища. Амінокислоти необхідні не тільки для синтезу протеїнів; деякі з них є попередниками в синтезі інших азотовмісних клітинних компонентів. Припустимо, що ми маємо три ауксотрофні мутанти, які нездатні синтезувати гліцин, глутамін та аспартат відповідно. Синтез яких азотовмісних продуктів (окрім протеїнів) буде порушеним у кожного з цих мутантів?

10. Інгібітори біосинтезу нуклеотидів. Запропонуйте механізм інгібування (а) аланінрацемази L-фтораланіном та (б) глутамінамідотрансферази азасерином.

11. (Медичний символ) Механізм дії сульфамідних препаратів. Деякі бактерії для нормального росту потребують наявності у культуральному середовищі p-амінобензоату. Ріст таких бактерій значно пригнічується при додаванні до середовища сульфаніламіду одного з перших сульфамідних препаратів. Окрім того, у присутності сульфаніламіду у культуральному середовищі накопичується 5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотид (АІКАР, див. Рис. 22-33). Обидва ефекти можуть бути зняті додаванням надлишку p-амінобензоату в середовище.

p–Амінобензоат Сульфаніламід

а) Яку роль виконує p-амінобензоат у цих бактеріях? (Підказка: див. рис. 18-16).

б) Чому за наявності сульфаніламіду накопичується 5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотид?

в) Чому додавання надлишку p-амінобензоату знімає як ефект пригнічення росту бактерій, так і накопичення 5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотиду?

12. Шлях атомів вуглецю у біосинтезі піримідинів. У яких положеннях виявиться ¹⁴С у складі оротату, виділеного з клітин, що вирощувались за наявності невеликої кількості рівномірно міченого [¹⁴С]сукцинату? Відповідь аргументуйте.

13. Нуклеотиди – неефективне джерело енергії. За умов голодування організм може використовувати у якості джерела енергії протеїни та амінокислоти. Внаслідок дезамінування амінокислот утворюються вуглецеві скелети, які включаються в шлях гліколізу або у цикл лимонної кислоти та перетворюються з виділенням енергії у формі АТР. Щодо нуклеотидів, то продукти їх розщеплення не використовуються як джерело енергії. Які спостереження з галузі клітинної фізіології підтверджують такий висновок? Завдяки яким особливостям будови нуклеотиди є відносно поганим джерелом енергії?

14. (Медичний символ) Лікування подагри. Інгібітор ксантиоксидази алопуринол (див. рис. 22-47) використовується для лікування хронічної подагри. Поясніть біохімічну основу такого лікування. У хворих, які отримували алопуринол, інколи утворюються ксантинові камені у нирках, хоча ураження сечовивідних шляхів у таких випадках зустрічаються набагато рідше, ніж у хворих з нелікованою подагрою. Поясніть це спостереження, використавши наступні дані розчинності вказаних сполук у сечі: сечова кислота – 0,15 г/л, ксантин – 0,05 г/л, гіпоксантин – 1,4 г/л.

15. Інгібування синтезу нуклеотидів азасерином. Діазосполука О-(2-діазоацетил)-L- серин, відома як азасерин (див. Рис. 22-48), є сильним інгібітором ензиму глутамінамідотрансферази. Якщо клітини, що інтенсивно ростуть, обробити азасерином, то які з проміжних продуктів біосинтезу нуклеотидів будуть накопичуватися? Відповідь поясніть.

Рисунок 22-1. Цикл азоту. Загальна кількість азоту, який щороку фіксується у біосфері, перевищує 10¹¹ кг.

(знизу)-Амінокислоти та інші відновлені сполуки, що містять азот і вуглець синтез у клітинах рослин та мікроорганізмів – деградація у клітинах тварин та мікроорганізмів Амоній NH₄⁺ - вліво нітрифікація грунтовими бактеріями ( наприклад, Nitrosomonas) Нітрит NО₂^- нітрифікація грунтовими бактеріями ( наприклад, Nitrobacter) Нітрат NО₃^- денітрифікація N₂ фіксація азоту деякими бактеріями ( наприклад, Klebsiella, Azotobacter, Rhizobium) відновлення у клітинах деяких анаеробних бактерій та у клітинах більшості рослин

Рисунок 22-2. Фіксація азоту нітрогеназним комплексом. Електрони переносяться від пірувату на динітрогеназу через фередоксин (або флаводоксин) та редуктазу динітрогенази. За один оборот редуктаза динітрогенази відновлює динітрогеназу за допомогою одного електрону, для фіксації однієї молекули N₂ необхідно принаймні шість електронів. Ще два електрони використовуються для відновлення 2Н⁺ до Н₂, цей процес обов’язково супроводжує фіксацію азоту анаеробними організмами. Таким чином, на одну молекулу N₂ загалом витрачається вісім електронів. Субодинична структура, метали - кофактори редуктази динітрогенази, а також протеїни, що входять до складу динітрогенази, описані у тексті та на рис. 22-3.

4 КоА + 4 пірувати 4 СО₂ + 4 ацетил-КоА

8 Фередоксинів або 8 флаводоксинів ( окиснених)

8 Фередоксинів або 8 флаводоксинів ( відновлених)

8 Редуктаз динітрогенази ( відновлених)

8 Редуктаз динітрогенази ( окиснених)

8 Редуктаз динітрогенази ( відновлених) + 16 АТР

8 Редуктаз динітрогенази ( окиснених) + 16 АТР

Динітрогеназа ( окиснена)

Динітрогеназа ( відновлена)

Рисунок 22-3. Ензими та кофактори нітрогеназного комплексу (отримано з PDB ID 1N2C). (а) На цій стрічкоподібній діаграмі субодиниці динітрогенази позначено сірим та рожевим кольором, а субодиниці редуктази динітрогенази – блакитним та зеленим. Зв’язаний АТР виділено червоним кольором. Зверніть увагу на комплекс 4Fe-4S (атоми Fe позначено помаранчевим, атоми S - жовтим кольором) та залізо-молібденовий кофактор (атом Мо позначено чорним, гомоцитрат – світлосірим кольором). Видно також Р-кластери (з’єднані пари 4Fe-4S - комплексів). (б) Кофактори динітрогеназного комплексу без протеїну (кольори такі ж, як і в (а). (в) Залізо-молібденовий кофактор, шо містить 1 атом Мо ( чорного кольору), 7 атомів Fe ( помаранчевого), 9 атомів S ( жовтого) та одну молекулу гомоцитрату (сірого кольору).

Рис. 22-4. Азотфіксуючі кореневі бульбочки. (а) Кореневі бульбочки лядвенцю рогатого з родини бобових. (б) Розфарбована електронна мікрофотографія тонкого зрізу кореневої бульбочки гороху. Азотфіксуючі бактерії-симбіонти, або бактероїди (червоного кольору), що живуть всередині бульбочкових клітин, оточені перибактероїдною мембраною (синього кольору). Бактероїди синтезують нітрогеназний комплекс, який перетворює атмосферний азот (N₂) на амоній (NH₄⁺); за відсутності бактероїдів рослина не здатна засвоювати N₂. Заселені бактеріями клітини кореня синтезують певні фактори, необхідні для фіксації азоту, зокрема, леггемоглобін. Цей гемовмісний протеїн проявляє високу спорідненість до зв’язування кисню, який сильно інгібує активність нітрогенази. (Ядра клітин забарвлені в жовто-зелений колір. В інфікованій бактеріями клітині кореня на цій мікрофотографії не вдається розрізнити інші органели, зазвичай наявні у рослинних клітинах).

Рисунок 22-5. Субодинична структура глутамінсинтетази, встановлена методом рентгеноструктурного аналізу (PDB ID 2GLS) (а) Вигляд збоку. Усі 12 субодиниць однакові, тут вони забарвлені різним кольором для демонстрації способу упаковки та розташування. (б) Вигляд зверху дозволяє побачити активні центри (зеленого кольору).

Рисунок 22-6. Алостерична регуляція глутамінсинтетази. Ензим зазнає сукупного впливу шести кінцевих продуктів метаболізму глутаміну. Аланін і гліцин, очевидно, виконують роль індикаторів загального статусу метаболізму амінокислот у клітині.

Глутамат глутамінсинтетаза Гліцин Аланін Глутамін Триптофан Гістидин Карбамоїлфосфат

Глюкозамін-6-фосфат

Рисунок 22-7. Другий рівень регуляції активності глутамінсинтетази: ковалентні модифікації. (а) Аденілілований залишок Tyr. (б) Каскад реакцій, що ведуть до аденілілування (інактивації) глутамінсинтетази. АТ позначає аденілілтрансферазу, UT – уридилілтрансферазу. Детально функціонування каскаду описано у тексті.

Ензим Аденін

α-Кетоглутарат Глутамат уридилілування

Глутамінсинтетаза (неактивна) аденілілування деаденілілування Глутамінсинтетаза (активна) Глутамін

Рисунок 22-8. Ймовірний механізм дії глутамінамідотрансферази. Кожен ензим має два домени. Домен, що зв’язує глютамін, містить структурні елементи, еволюційно консервативні для багатьох із цих ензимів, серед них і необхідний для функціонування ензиму залишок Cys. Водночас структура NH₃–акцепторного домену (що зв’язує другий субстрат) може бути різною.  Азот γ-амідної групи глутаміну (червоного кольору) вивільнюється у формі NH₃ у реакції, в ході якої, як припускають, утворюється ковалентно зв’язаний проміжний продукт глутаміл-ензим. NH₃ мігрує по каналу до другого активного центру, де  реагує з будь-яким із кількох можливих акцепторів. Наведено два типи акцепторів аміногруп. Літера Х позначає активуючу групу, як правило, це фосфорильна група, що походить з АТР і прискорює заміщення гідроксильної групи у складі R-ОН на NH₃.

Глутамін-зв’язувальний домен NH₃–акцепторний домен NH₃–канал Глутамін Глутамінамідотрансфераза Акцептор Активований субстрат Проміжний продукт глутаміл-ензим

Глутамат

Таблиця 22-1 Поділ амінокислот на родини залежно від природи метаболічного попередника, з якого вони синтезуються

α- Кетоглутарат	Піруват
Глутамат Глутамін Пролін Аргінін*	Аланін Валін* Лейцин* Ізолейцин*
3-фосфогліцерат	Фосфоенолпіруват та еритрозо-4-фосфат
Серин Гліцин Цистеїн	Триптофан* Фенілаланін* Тирозин**
Оксалоацетат	Рибозо-5-фосфат
Аспартат Аспарагін Метіонін* Треонін* Лізин*	Гістидин*

* незамінні амінокислоти

** у ссавців утворюється з фенілаланіну

Рисунок 22-9. Загальна схема біосинезу амінокислот. Вуглецеві скелети попередників амінокислот походять з трьох основних джерел: гліколізу (забарвлені рожевим кольором), циклу лимонної кислоти (блакитні) та пентозофосфатного шляху (фіолетові).

Глюкоза

Глюкозо-6-фосфат 4 етапи Рибозо-5-фосфат Гістидин

Еритрозо-4-фосфат 3-Фосґфогліцерат – Серин Фосфоенолпіруват Гліцин Цистеїн Триптофан Фенілаланін Тирозин Піруват Аланін Валін Лейцин Ізолейцин Цитрат Оксалоацетат α-Кетоглутарат Аспартат Глутамат Аспарагін Метіонін Треонін Лізин Глутамін Пролін Аргінін

Рисунок 22-10. Біосинтез проліну та аргініну з глутамату у бактерій. Усі п’ять атомів вуглецю проліну походять від глутамату. У багатьох організмах глутаматдегідрогеназа може використовувати у якості кофактора як NADH, так і NADPH. Така особливість притаманна і іншим ензимам, задіяним у цих шляхах. γ-Напівальдегід, що утворюється у процесі синтезу проліну, зазнає швидкої зворотної циклізації з утворенням ∆¹-піролін-5-карбоксилату (П5К), рівновага цієї реакції зміщена у бік утворення П5К. В орнітин/аргініновому шляху реакції циклізації запобігає ацетилювання α- аміногрупи глутамату на першому етапі та видалення ацетильної групи після трансамінування. Хоча у деяких бактерій аргіназа, а отже і повний цикл сечовини, відсутні, проте вони можуть синтезувати аргінін з орнітину за допомогою реакцій, аналогічних тим, що протікають у циклі сечовини у ссавців, тобто з утворенням цитруліну та аргініносукцинату як проміжних метаболітів ( див. Рис. 18-10).

Тут і на наступних рисунках цього розділу стрілками позначено напрямок реакцій до утворення кінцевих продуктів без зазначення оборотності окремих етапів. Наприклад, другий етап шляху синтезу аргініну, який каталізує N-ацетилглутаматдегідрогеназа, за хімізмом подібний до гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназної реакції у процесі гліколізу (див. рис. 14-7) і може легко протікати у зворотному напрямку.

Глутамат – ацетилглутаматсинтетаза – N-ацетилглутамат

глутаматкіназа

γ –Глутамілфосфат

глутаматдегідрогеназа

Глутамат- γ – напівальдегід

неензиматичне перетворення

∆¹-Піролін-5-карбоксилат (П5К)

піролінкарбоксилатредуктаза

Пролін

ацетилглутаматсинтаза

N-ацетилглутамат

N-ацетилглутаматкіназа

N-Ацетил- γ- глутамілфосфат

N-ацетилглутаматдегідрогеназа

N-ацетилглутамат- γ-напівальдегід

Глутамат

амінотрансфераза

α - Кетоглутарат

N- Ацетилорнітин

N- ацетилорнітиназа

Цикл сечовини

Орнітин

Карбамоїлфосфат

орнітинкарбамоїллтрансфераза

L-Цитрулін

аргініносукцинатсинтетаза

Аргініносукцинат

аргініносукциназа

Фумарат

Аргінін

Рисунок 22-11. Орнітин-δ-амінотрансферазна реакція: етап на шляху синтезу проліну у ссавців. У більшості клітин цей ензим локалізований у мітохондріальному матриксі. Рівновага реакції зміщена у бік утворення П5К, проте у випадку, коли рівень аргініну недостатній для синтезу протеїнів, єдиним шляхом синтезу орнітину (а, отже, і аргініну) у ссавців є зворотна реакція

Орнітин

α-Кетоглутарат Глутамат

орнітин-δ-амінотрансфераза

Глутамат-γ-напівальдегід

∆¹-Піролін-5-карбоксилат (П5К)

Рисунок 22-12. Спільний для усіх організмів шлях біосинтезу серину з 3-фосфогліцерату та гліцину із серину. Гліцин може також утворюватися з СО₂ та NH₄⁺ під дією гліцинсинтази за участю N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолату як донора метильних груп (див. текст).

3-Фосфогліцерат

фосфогліцератдегідрогеназа

3-Фосфогідроксипіруват

Глутамат α-Кетоглутарат

фосфосеринамінотрансфераза

3-Фосфосерин

фосфосеринфосфатаза

Серин

серингідроксиметилтрансфераза

Н₄-фолат N⁵,N¹⁰-Метилен-Н₄-фолат

Гліцин

Рисунок 22-13. Біосинтез цистеїну з серину у бактерій та рослин. Праворуч наведено шлях утворення відновленої сірки.

Справа: АТР-сульфурилаза

Аденін

Аденозин-5’-фосфосульфат (АФС)

3’-Фосфоаденозин-5’-фосфосульфат (ФАФС)

ФАФС-редуктаза

3’-Фосфоаденозин-5’-фосфат (ФАФ)

Сульфіт

сульфідредуктаза

Сульфід

Зліва:

Серин

серинацетилтрансфераза

О-Ацетилсерин

О-ацетилсерин(тіол)ліаза

Цистеїн

Рисунок 22-14. Біосинтез цистеїну з гомоцистеїну та серину у ссавців. Гомоцистеїн утворюється з метіоніну як описано у тексті.

Гомоцистеїн

цистатіонін-β-синтаза

Серин

Цистатіонін

цистатіонін-γ-ліаза

α-Кетобутират

Цистеїн

Рисунок 22-15. Біосинтез шести незамінних амінокислот з оксалоцетату та пірувату у бактерій: метіоніну, треоніну, лізину, ізолейцину, валіну та лейцину. У цьому та інших багатоетапних метаболічних шляхах назви відповідних ензимів наведено у вставці. Зверніть увагу, що L,L-α,ε-диамінопімелат, продукт етапу 14, є симетричним. Атоми вуглецю, які походять з пірувату (та аміногрупа, донором якої є глутамат) після етапу 14 на схемі не виділено, тому що внаслідок наступних реакцій вони можуть локалізуватися на будь-якому з кінців молекули лізину.

Аспартат

Аспартил-β-фосфат

Аспартат-β-напівальдегід

Піруват

Дигідропіколінат

Δ¹–Піперідин-2,6-дикарбоксилат

Сукциніл-КоА

Сукцинат

N-сукциніл-2-аміно-6-кето-L-пімелат

Глутамат

α-Кетоглутарат

Сукцинат

N-Сукциніл -L,L- α,ε- діамінопімелат

Сукцинат

L,L- α,ε- Діамінопімелат

мезо- α,ε- Діамінопімелат

Лізин

Справа

Треонін ПФ

Фосфогомосерин

Гомосерин

Сукциніл-КоА

О-Cукцинілгомосерин

Сукцинат

Цистеїн ПФ Сукцинат

Цистатіон

Піруват

Гомоцистеїн

N⁵-Метил-Н₄-фолат

Н₄-фолат

Метіонін

С.847

Піруват

ТПФ

α-Кетобутират Піруват

α-Ацето-α-гідроксибутират α-Ацетолактат

α.β-Дигідрокси-β-метилвалеріат α.β-Дигідрокси-β-ізовалеріат

α-Кето-β-метилвалеріат α-Кето-ізовалеріат

Глутамат ПФ α-Кетоглутарат

Глутамат ПФ α- Кетоглутарат

Ізолейцин

Валін

Ацетил-КоА – на стрілці

α-Ізопропілмалат

β-Ізопропілмалат

β-Кетоізокапроат

Глутамат ПФ α-Кетоглутарат

Лейцин

Вставка. Кружки треба

1. аспартаткіназа

2. аспартат-β-напівальдегіддегідрогеназа

3. гомосериндегідрогеназа

4. гомосеринкіназа

5. треонінсинтаза

6. гомосеринацилтрансфераза

7. цистатіонін-γ-синтаза

8. цистатіонін- β-ліаза

9. метіонінсинтаза

10. дигідропіколінатсинтаза

11. Δ¹ – піперідин-2,6-дикарбоксилатдегідрогеназа

12. N-сукциніл-2-аміно-6-кетопімелатсинтаза

13. сукцинілдіамінопімелатамінотрансфераза

14. сукцинілдіамінопімелатдесукцинілаза

15. діамінопімелатепімераза

16. діамінопімелатдекарбоксилаза

17. треоніндегідратаза (сериндегідратаза)

18. ацетолактатсинтаза

19. ізомероредуктаза ацетогідроксикислоти

20. дегідратаза дигідроксикислоти

21. валінамінотрансфераза

22. α-ізопропілмалатсинтетаза

23. ізопропілмалатізомераза

24.β-ізопропілмалатдегідрогеназа

25. лейцинамінотрансфераза

Рисунок 22-16. Біосинтез хоризмату - проміжного метаболіту на шляху синтезу ароматичних амінокислот у бактерій та рослин. Усі атоми вуглецю цієї сполуки походять від еритрозо-4-фосфату (забарвлені фіолетовим кольором) або фосфоенолпірувату (рожеві). Зверніть увагу, що NAD⁺, необхідний у якості кофактора на етапі 2, вивільнюється у незміненому вигляді; під час реакції він може тимчасово відновлюватися до NADH з утворенням окисненого проміжного продукту. Етап  конкурентно інгібується гліфосатом (¯СОО ─ СН₂─ NH─ CH₂─PO₃^2¯), активним компонентом поширеного гербіциду Roundup. Гербіцид порівняно нетоксичний для ссавців, оскільки у них цей шлях біосинтезу відсутній. Хімічні назви хінат, шикимат та хоризмат походять від назв рослин, які накопичують ці проміжні метаболіти.

Фосфоенолпіруват (ФЕП)

Еритрозо-4-фосфат

2-Кето-3-дезокси-D-арабіногептулозонат-7-фосфат

3- Дегідрохінат

3-Дегідрошикимат

3-Дегідрошикимат

Шикимат

Шикимат-3-фосфат

5- Енолпірувілшикимат-3-фосфат

Хоризмат

Вставка.

 2-кето-3-дезокси-D-арабіногептулозонат-7-фосфатсинтаза

 дегідрохінатсинтаза

 3-дегідрохінатдегідратаза

 шикиматдегідрогеназа

 шикиматкіназа

 5-енолпірувілшикимат-3-фосфатсинтаза

 хоризматсинтаза

Рисунок 22-17. Біосинтез триптофану з хоризмату у бактерій та рослин. У клітинах Е.coli ензими, що каталізують етапи  та , є субодиницями одного комплексу.

Хоризмат

Глутамін

Глутамат

Піруват

Антранілат

ФРПФ

N-(5^’-Фосфорибозил)-антранілат

Енол-1-о-карбоксифеніламіно-1-дезоксирибулозофосфат

Індол-3-гліцеролфосфат

Гліцеральдегід-3-фосфат

Серин ПФ

Триптофан

Вставка.

антранілатсинтаза

 антранілатфосфорибозилтрансфераза

 N-(5^’-фосфорибозил)-антранілатізомераза

 індол-3-гліцеролфосфатсинтаза

 триптофансинтаза.

Рисунок 22-18. Триптофансинтазна реакція. Ензим каталізує багатоетапну реакцію, яка включає декілька типів хімічних перебудов.  Внаслідок реакції альдольного розщеплення, яка не потребує наявності ПФ, утворюються індол та гліцеральдегід-3-фосфат.  Дегідратація серину веде до утворення проміжного метаболіту піридоксальфосфат-аміноакрилат, який на етапах  та  конденсується з індолом. Утворений продукт гідролізується на етапі  з вивільненням триптофану. У цих перетвореннях, що прискорюються піридоксальфосфатом, бере участь β-вуглецевий атом (С-3) амінокислоти, а не α-вуглецевий атом, як це має місце у випадку реакцій, наведених на Рис. 18-6. β-вуглецевий атом серину приєднується до індольного кільця. Механізм дії триптофансинтази

Індол-3-гліцеролфосфат

α-субодиниці триптофансинтази

Гліцеральдегід-3-фосфат

Індол

β-субодиниці триптофансинтази

Серин

Індол

ПФ-аміноакрилатний аддукт

Хіноїдний проміжний метаболіт

Альдімін з триптофаном

Ензим ПФ

Триптофан

Рисунок 22-19. Біосинтез фенілаланіну та тирозину з хоризмату у бактерій і рослин. Перетворення хоризмату на префенат є прикладом перегрупування Клайзена, яке рідко зустрічається в біологічних реакціях.

Хоризмат

Префенат

4-Гідроксифенілпіруват Фенілпіруват

Глутамат амінотрансфераза α-Кетоглутарат – 2 рази

Тирозин Фенілаланін

Вставка.

 хоризматмутаза

 префенатдегідрогеназа

 префенатдегідратаза

Рисунок 22-20. Біосинтез гістидину у бактерій та рослин. Атоми, які походять з ФРПФ та АТР, затінено рожевим і блакитним кольорами відповідно. Два атоми азоту гістидину походять з глутаміну та глутамату (зеленого кольору). Зверніть увагу, що похідне АТР, яке утворюється на етапі 5 (АІКАР) є проміжним метаболітом на шляху біосинтезу пуринів (див. Рис. 22-33, етап ), так що вміст АТР швидко відновлюється.

5- Фосфорибозил-1-пірофосфат (ФРПФ)

N¹-5’- Фосфорибозил-АТР N¹-5’- Фосфорибозил-АМР

До біосинтезу пуринів Риб- 3 рази

5-Аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклетид (АІКАР

Глутамін Глутамат

N¹- 5’- фосфорибозилформіміно-5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклетид

N¹- 5’- фосфорибозилформіміно-5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклетид

Імідазолгліцерол-3-фосфат

Імідазолацетол-3-фосфат

Глутамат – α-Кетоглутарат

L-Гістидинолфосфат

L-Гістидинол

Гістидин

Вставка.

1. АТР-фосфорибозилтрансфераза

2. пірофосфогідролаза

3. фосфорибозил-АМР-циклогідролаза

4. фосфорибозилформіміно-5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотидізомераза

5. глутамінамідотрансфераза

6. імідазолгліцерол-3-фосфатдегідратаза

7. L- гістидинолфосфатамінотрансфераза,

8. гістидинолфосфатфосфатаза,

9. гістидинолдегідрогеназа.

Рисунок 22-21. Алостерична регуляція біосинтезу ізолейцину. Перша реакція шляху синтезу ізолейцину з треоніну інгібується кінцевим продуктом, ізолейцином. Це один з перших досліджених прикладів алостеричного інгібування за типом зворотного зв’язку. Перетворення від α-кетобутирату до ізолейцину відповідають етапам 18-21 на рисунку 22-15 (загалом п’ять етапів, тому що реакція 19 є двохетапною).

Треонін

треоніндегідратаза

α-Кетобутират

5 етапів

Ізолейцин

Рисунок 22-22. Схема регуляторних механізмів, що контролюють біосинтез декількох амінокислот з аспартату у E. coli. Три ензими ( А, В і С) існують у двох або трьох ізозимних формах, які позначено за допомогою нижніх індексів. Один з ізозимів кожного з трьох ензимів (А_2, Б₁ та С₂) регулюється не алостерично, а шляхом зміни кількості синтезованого протеїну (Розділ 28). Синтез ізозимів А₂ та В₁ репресується при підвищенні вмісту метіоніну, а ізозиму С2 - ізолейцину. Позначення ензимів: А – аспартокіназа, В – гомосериндегідрогеназа, С – треоніндегідратаза.

Аспартат

Аспартил-β-фосфат

Аспартат- β-напівальдегід - 6 етапів

Лізин Гомосерин – 3 етапи

Метіонін

Треонін

α-Кетобутират – 5 етапів

Ізолейцин

Рисунок 22-23. Біосинтез δ-амінолевулінату. (а) У більшості тварин, у тому числі і у ссавців, δ-амінолевулінат синтезується з гліцину та сукциніл-КоА. Атоми, що походять з гліцину, забарвлені в червоний колір. (б) У бактерій і рослин попередником δ-амінолевулінату є глутамат.

(а) Сукциніл-КоА

Гліцин

δ-амінолевулінатсинтаза

α-Аміно-β-кетоадіпат

δ-амінолевулінатсинтаза

δ-Амінолевулінат

глутамат-1-напівальдегідаміномутаза

(б) Глутамат

тРНК – 3 рази

глутаміл-тРНК-синтетаза

Глутаміл-тРНК^Glu

глутаміл-тРНК-редуктаза

Глутамат-1-напівальдегід

Рисунок 22-24. Біосинтез гему з δ-амінолевулінату. Ац означає ацетил (─СН₂СОО^¯ ), Пр - пропіоніл (─СН₂СН₂СОО^¯)

δ-Амінолевулінат

Порфобіліноген

Преуропорфіриноген

Уропорфіриноген ІІІ

Копропорфіриноген ІІІ

Протопорфіриноген

Протопорфірин

Гем

 порфобіліногенсинтаза;

 уропорфіриногенсинтаза

 уропорфіриноген-ІІІ-косинтаза

 уропорфіриногендекарбоксилаза

 копропорфіриногеноксидаза

 протопорфіриногеноксидаза

 ферохелатаза

Рисунок 22-25. Білірубін та продукти його розпаду. Позначення (на формулах) М – метил, В – вініл, Пр – пропіоніл, Е – етил. Для кращого порівняння наведено лінійні структури проміжних продуктів, хоча правильними є стереохімічні конформації.

Гем

гемоксигеназа

Білівердин

білівердинредуктаза

Білірубін (у крові)

глюкуронілбілірубінтрансфераза (печінка)

транспорт в крові у формі комплексу з альбуміном сироватки

Білірубіндиглюкуронід

транспорт до кишковика

Білірубін (у жовчі)

Уробіліноген

транспорт до нирок

Уробіліноген

Уробілін

Стеркобілін

Рисунок 22-26. Біосинтез креатину та фосфокреатину. Креатин синтезується з трьох амінокислот: гліцину, аргініну та метіоніну. Цей біосинтетичний шлях демонструє, що амінокислоти слугують попередниками різноманітних азотовмісних біомолекул.

Гліцин Аргінін

амідінотрансфераза Орнітин

Гуанідиноацетат

метилтрансфераза Метіонін

Креатин

креатинкіназа

Фосфокреатин

Рисунок 22-27. Метаболізм глутатіону

(а) Біосинтез глутатіону, (в) Відновлена форма глутатіону.

Глутамат

Цистеїн

γ-глутамілцистеїнсинтетаза

Гліцин

глутатіонсинтетаза

Глутатіон (GSH)

Глутатіон (GSH) ( відновлений)

Глутатіон (GSSG) ( окиснений)

Рисунок 22-28. Біосинтез двох рослинних сполук з амінокислот. (а) Індол-3-ацетат (ауксин) та (б) цинамат (коричний аромат)

Триптофан

амінотрансфераза

Індол-3-піруват

декарбоксилаза

Індол-3-ацетат (ауксин)

Фенілаланін

фенілаланінамонійліаза

Цинамат

Рисунок 22-29. Біосинтез деяких нейротрансмітерів із амінокислот. Головним етапом в усіх наведених шляхах є ПФ-залежне декарбоксилювання (затінено рожевим кольором)

Тирозин

Тетрагідробіоптерин

тирозингідроксилаза

Дигідробіоптерин

Допа

декарбоксилаза ароматичних амінокислот

ПФ

Дофамін

Аскорбат

дофамін-β-гідроксилаза

Дегідроаскорбат

Норепінефрин

фенілетаноламін-N-метилтрансфераза

Епінефрин

Глутамат

глутаматдекарбоксилаза ПФ

γ-Амінобутират (ГАМК)

Гістидин

Гістидиндекарбоксилаза ПФ

Гістамін

Триптофан

Тетрагідробіоптерин

триптофангідроксилаза

Дигідробіоптерин

5-Гідрокситриптофан

декарбоксилаза ароматичних амінокислот ПФ

Серотонін

Рисунок 22-30. Біосинтез спермідину та сперміну. Етапи ПФ-залежного декарбоксилювання затінено рожевим кольором. У цих реакціях S- аденозилметіонін (в декарбоксильованій формі) виконує роль донора пропіламінових груп (затінено блакитним кольором).

Метіонін

S- аденозилметіонін

Аденозин

АdоМеt-декарбоксилаза ПФ

Аденозин

Декарбоксильований аdоМеt

Орнітин

орнітиндекарбоксилаза ПФ

Путресцин

пропіламінотрансфераза І

Аденозин

Метилтіоаденозин

Спермідин

пропіламінотрансфераза ІІ

Аденозин

Спермін

Рисунок 22-31. Біосинтез оксиду азоту. Обидва етапи каталізуються синтазою оксиду азоту. Азот молекули NO походить з гуанідинової групи аргініну.

Аргінін

Гідроксиаргінін

Цитрулін

Оксид азоту

Рисунок 22-32. Походження атомів пуринового кільця. Інформацію отримано в експериментах з використанням попередників, мічених ¹⁴С або ¹⁵N. Форміат надходить у вигляді N¹⁰-формілтетрагідрофолату.

Аспартат

Форміат

Амідний азот глутаміну

Форміат

Гліцин

Рисунок 22-33. Синтез de novo пуринових нуклеотидів: побудова пуринового кільця інозинату (ІМР). Сполуки, що беруть участь у побудові кільця, затінено тими ж кольорами, що і на рис. 22-32. Після етапу  літерою R позначено 5-фосфо-D-рибозильну групу, на якій будується пуринове кільце. Першим етапом синтезу пуринів є утворення 5-фосфорибозиламіну (етап ). Зверніть увагу, що продукт етапу  (АІКАР) – це залишок молекули АТР, вивільнений під час біосинтезу гістидину (див. Рис. 22-20, етап ). Назви більшості проміжних метаболітів біосинтетичного шляху подаються у скороченій формі, щоб спростити назви відповідних ензимів. Етап 6а – це альтернативний шлях від 5-аміноімідазол-рибонуклеотиду (АІР) до карбоксиаміноімідазол-рибонуклеотиду (КАІР), який реалізується у вищих еукаріотів.

5-Фосфорибозил-1-пірофосфат (ФРПФ

Глутамін- Глутамат

5-Фосфо-β-D-рибозиламін

Гліцин

Гліцинамід-рибонуклеотид (ГАР)

N ¹⁰ –Форміл-Н₄-фолат Н₄-фолат

Формілгліцинамід-рибонуклеотид (ФГАР)

Глутамін Глутамат

Формілгліцинамід-рибонуклеотид ( ФГАР)

Формілгліцинамідин- рибонуклеотид ( ФГАМР)

5-Аміноімідазол-рибонуклеотид (АІР)

N ⁵-карбоксиаміноімідазол-рибонуклеотид (N ⁵-КАІР)

Карбоксиаміноаміноімідазол-рибонуклеотид (КАІР)

Аспартат

N- Сукциніл-5-аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотид (САІКАР)

Фумарат

5-Аміноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотид (АІКАР)

N ¹⁰ –Форміл-Н₄-фолат Н₄- фолат

N-Форміламіноімідазол-4-карбоксамід-рибонуклеотид (ФАІКАР)

Інозинат (ІМР)

1. глутамін-ФРПФ-амідотрансфераза,

. ГАР-синтетаза,

. ГАР-трансформілаза,

. ФГАР-амідотрансфераза,

. ФГАМР-циклаза (АІР-синтетаза),

 N⁵-КАІР-синтетаза,

6а. АІР-карбоксилаза,

. N⁵-КАІР-мутаза,

. САІКАР-синтетаза,

. САІКАР-ліаза,

. АІКАР-трансформілаза,

11. ІМР-синтаза.

Рисунок 22-34. Біосинтез AMP та GMP із IMP.

(Верхня частина рисунку)

Інозинат (IMP)

Аспартат

аденілосукцинатсинтетаза

Аденілосукцинат

Фумарат

аденілосукцинатліаза

Аденілат (АМР)

(Нижня частина рисунку)

ІМР-дегідрогеназа

Ксантилат (XМР)

ХМР-глутамінамідотрансфераза

Гуанілат (GMP)

Рисунок 22-35. Механізми регуляції біосинтезу аденінових та гуанінових нуклеотидів у E. coli. У інших організмів регуляція цих біосинтетичних шляхів відрізняється.

Рибозо-5фосфат

Рибозофосфатпірофосфокіназа (ФРПФ - синтетаза)

ФРПФ

глутамін-ФРПФ-амідотрансфераза

5-Фосфорибозиламін

9 етапів

аденілілосукцинатсинтетаза

Аденілілосукцинат

аденілілосукцинатліаза

ІМР-дегідрогеназа

ХМР

ХМР-глутамінамідотрансфераза

GMP

Рис. 22-36. Синтез de novo піримідинових нуклеотидів: біосинтез UTP і CTP через оротидилат. Вихідними сполуками у побудові піримідинів є карбамоїлфосфат і аспартат. До завершеного піримідинового кільця приєднується рибозо-5-фосфат за участю ензиму оротатфосфорибозилтрансферази. На першому етапі цього шляху (тут не наведено, див. Рис.18-11а) із СО₂ та NH₄⁺ синтезується карбамоїлфосфат, у еукаріотів цю реакцію каталізує ензим карбамоїлфосфатсинтетаза ІІ.

Аспартат

аспартаттранскарбамоїлаза

Карбамоїлфосфат

N-Карбамоїласпартат

дигідрооротаза

L-Дигідрооротат

дигідрооротатдегідрогеназа

Оротат

оротатфосфорибозилтрансфераза

Оротидилат

оротидилатдекарбоксилаза

Уриділат (UMP)

кінази

Уридин-5'-трифосфат (UTP)

цитидилатсинтетаза

Цитидин-5'-трифосфат (CTP)

Рисунок 22-37. „Каналування” проміжних метаболітів у бактеріальній карбамоїлфосфатсинтетазі. (Отримано із PDB ID 1M6V). Реакцію, яку каталізує цей ензим, наведено на Рис. 18-11а. Великі та малі субодиниці виділено сірим та блакитним кольорами відповідно, канал між активними центрами (близько 100 Å завдовжки) зображено у вигляді жовтої сітки. Молекула глутаміну (зелена) зв’язується з малою субодиницею та віддає амідний атом азоту у вигляді NH₄⁺ у реакції глутамінамідотрансферазного типу. NH₄⁺ потрапляє у канал і переміщується по ньому до другого активного центру, де взаємодіє з бікарбонатом у реакції, що потребує АТР (зв’язаний у другому активному центрі ADP виділено блакитним). Утворений карбамат знову поступає у канал і переміщується до третього активного центру, де фосфорилюється з утворенням карбамоїлфосфату (зв’язаний ADP виділено червоним).

Рисунок 22-38. Алостерична регуляція аспартаттранскарбамоїлази за участю CTP та ATP. За наявності 0,8мМ CTP, алостеричного інгібітора АТКази, зростають величина К_0,5 для аспартату (нижня крива) і швидкість перетворення його на N-карбамоїласпартат. АТР у концентрації 0,6 мМ повністю знімає цей ефект (середня крива).

мкМ/хв. 12 мМ 23 мМ [Аспартат] (мм.)

Активність у контролі (без СТР)

Рисунок 22-39. Відновлення рибонуклеотидів до дезоксирибонуклеотидів під дією рибонуклеотидредуктази. Електрони переносяться (блакитні стрілки) від NADPH на ензим за участю: (а) глутаредоксину або (б) тіоредоксину. Для відновлення дисульфідного зв'язку у складі глутаредоксинредуктази використовуються дві молекули глутатіону (GSH; GSSG – окиснений глутатіон). Зверніть увагу, що тіоредоксинредуктаза є флавопротеїном, у якому роль простетичної групи виконує FAD.

Рибонуклеотидредуктаза Рибонуклеотидредуктаза

Глутаредоксин Глутаредоксин Тіоредоксин Тіоредоксин

глутаредоксинредуктаза тіоредоксинредуктаза

Глутатіонредуктаза

Рисунок 22-40. Рибонуклеотидредуктаза. (а) Субодинична структура. Функції двох регуляторних центрів пояснено на Рис. 22-42. Кожний активний центр містить два тіоли та групу (-ХН), яка може в активному центрі перетворюватися на радикал; можливо, у ролі такої групи виступає -SH-група залишку Cys⁴³⁹, яка функціонує як тіоїльний радикал. (б) R2-субодиниці рибонуклеотидредуктази E. coli (PDB ID 1PFR). Залишок Tyr, який діє як тирозильний радикал, позначено червоним кольором, залізовмісний центр – помаранчевим. (в) Тирозильний радикал ініціює утворення в активному центрі радикалу (-Х), який використовується у механізмі рибонуклеотидредуктазної реакції, наведеному на рис. 22-41.

Алостеричні ефектори

Субстрати

Активний центр

Головний регуляторний центр

Субстрат-специфічний центр

Регуляторні центри

R1-субодиниця - двічі

R2-субодиниця

Рисунок 22-41. Вірогідний механізм дії рибонуклеотидредуктази. У ензимах клітин E. coli та більшості еукаріотів активні тіолові групи розміщені на субодиниці R1; радикал (-Х^∙) у складі активного центру розміщений на субодиниці R2, у E. coli це, можливо, тіоїльний радикал залишку Cys⁴³⁹ (див. Рис. 22-40). Етапи реакцій від  до  описано у тексті.

R1-субодиниця

Основа – 6 разів

Рибонуклеотидредуктаза

R2-субодиниця

Тіоредоксин S-S ( глутаредоксин)

Tіоредоксин (SH)₂ ( глутаредоксин)

Рисунок 22-42. Регуляція активності рибонуклеотидредуктази за участю дезоксинуклеозидтрифосфатів. Загальна активність ензиму регулюється шляхом зв’язування молекул-ефекторів з регуляторним центром першого типу (ліворуч). Субстратна специфічність ензиму визначається природою ефекторної молекули, яка зв’язується з регуляторним центром другого типу (праворуч). На схемі вказано інгібування чи стимуляцію ензиматичної активності чотирма різними субстратами. Шлях перетворення dUDP на dTTP описано нижче (див. Рис. 22-43, 22-44).

Регуляція в головних регуляторних центрах

Регуляція в субстрат-специфічних центрах

Продукти Субстрати Продукти

Рисунок 22-43. Біосинтез тимідилату (dTMP). Наведено шляхи синтезу, починаючи з реакції, яку каталізує ензим рибонуклеотидредуктаза. На рис. 22-44 подано схему тимідилатсинтазної реакції.

рибонуклеотидредуктаза

нуклеозиддифосфаткіназа

дезаміназа

dUTPаза

тимідилатсинтаза

Рисунок 22-44. Перетворення dUMP на dTMP під дією тимідилатсинтази та дигідрофолатредуктази. Регенерацію N⁵,N¹⁰-метиленової форми тетрагідрофолату в ході синтезу dTMP каталізує ензим серингідроксиметилтрансфераза. Усі три атоми водню у складі приєднаної метильної групи походять з N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолату (виділено рожевим та сірим кольорами).

тимідилатсинтаза

N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолат 7,8-Дигідрофолат

Гліцин - ПФ – Серин

серингідроксиметилтрансфераза дигідрофолатредуктаза

Тетрагідрофолат

Рисунок 22-45. Катаболізм пуринових нуклеотидів. Зверніть увагу, що у приматів переважна кількість азоту виводиться з організму у складі сечовини завдяки функціонуванню циклу сечовини (Глава 18), а не у складі сечової кислоти, яка утворюється при розпаді пуринів. Так само у риб значно більша кількість азоту виділяється у вигляді NH₄⁺, а не у вигляді сечовини, що утворюється згідно наведеної схеми.

5’-нуклеотидаза

Аденозин

аденозиндезаміназа

Інозин

нуклеозидаза

Рибоза

Гіпоксантин ( кетоформа)

ксантиноксидаза

Ксантин ( кетоформа)

ксантиноксидаза

Сечова кислота

зліва

5’-нуклеотидаза

Гуанозин

нуклеозидаза

Рибоза

Гуанін

гуаніндезаміназа

справа, зняти табличку

	Виводиться з організму:
Сечова кислота	приматів, птахів, рептилій, комах
уратоксидаза
Алантоїн	більшості ссавців
алантоїназа
Алантоат	кісткових риб
алантоіказа
Гліоксилат
Сечовина	амфібій, хрящових риб
уреаза
NH4+	морських безхребетних

Рисунок 22-46. Катаболізм піримідинів. На схемі представлено шлях розпаду тиміну. Напівальдегід метилмалонілу в подальшому розщеплюється до сукциніл-КоА.

Тимін

дигідроурацилдегідрогеназа

Дигідротимін

дигідропіримідиназа

β-Уреїдоізобутират

β-уреїдопропіоназа

β-Аміноізобутират

α-Кетоглутарат

амінотрансфераза

Глутамат

Метилмалонілнапівальдегід

Рисунок 22-47. Алопуринол – інгібітор ксантиноксидази. Зазвичай субстратом ксантиноксидази є гіпоксантин. Внаслідок незначної зміни у структурі (затінено рожевим кольором) гіпоксантин перетворюється на алопуринол, який ефективно інгібує активність ензиму ксантиноксидази і використовується як лікарський препарат. В активному центрі ксантиоксидази алопуринол перетворюється на оксипуринол – сильний конкурентний інгібітор, який залишається міцно зв’язаним із відновленою формою ензиму.

Алопуринол

ксантиноксидаза

Оксипуринол

Гіпоксантин (енольна форма)

Рисунок 22-48. Азасерин та ацивіцин, інгібітори глутамінамідотрансфераз. Ці аналоги глутаміну впливають на активність багатьох ензимів, що каталізують реакції шляхів біосинтезу амінокислот та нуклеотидів.

Глутамін

Азасерин

Ацивіцин

(Медичний символ) Рисунок 22-49. Синтез тимідилату та метаболізм фолату як мішені дії хіміотерапевтичних препаратів. (а) У ході синтезу тимідилату N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолат перетворюється на 7,8-дигідрофолат; регенерація N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолату відбувається впродовж двох етапів (див. Рис. 22-44). Цей цикл є головною мішенню дії декількох хіміотерапевтичних препаратів. (б) Структура важливих хіміотерапевтичних препаратів фторурацилу та метотрексату. У клітині фторурацил перетворюється на FdUMP, який інгібує активність тимідилатсинтази. Метотрексат, структурний аналог тетрагідрофолату, інгібує активність дигідрофолатредуктази; кольором виділено аміно та метильну групи, які заміщають карбонільний кисень та протон у складі фолату відповідно (див. Рис. 22-44). Інший важливий аналог фолату, аміноптерин, має таку ж структуру, як і метотрексат, але позбавлений метильної групи. Антибіотик триметоприм є інгібітором, що міцно зв’язується з дигідрофолатредуктазою у бактерій.

тимідилатсинтаза

7,8–Дигідрофолат

дигідрофолатредуктаза Метотрексат Аміноптерин Триметоприм

Н4-фолат

серингідроксиметилтрансфераза

Серин ПФ Гліцин

N ⁵,N ¹⁰ – Метилен-Н₄-фолат

Фторурацил

Триметоприм

Метотрексат

Рис. 22-50. Перетворення dUMP на dTMP та його пригнічення FdUMP. Зверху наведено механізм звичайної реакції, яку каталізує тимідилатсинтаза. Нуклеофільну сульфгідрильну групу ензиму, задіяну в каталізі на етапі , та атоми піримідинового кільця dUMP, які беруть участь у реакції, виділено червоним кольором. Символом :В позначено бічний ланцюг амінокислотного залишку, який необхідний для відщеплення протона після етапу  . Атоми водню, що надходять від метиленової групи N⁵,N¹⁰-метилентетрагідрофолату, виділено сірим кольором. Незвичним у механізмі цієї реакції є переміщення 1,3 гідриду (етап 3), внаслідок якого гідрид-іон (виділений рожевим) переноситься від атому С-6 у складі Н₄-фолату до метильної групи тимідину, що призводить до окиснення тетрагідрофолату і утворення дигідрофолату. Такого переміщення гідриду напевне не відбувається, якщо субстратом є FdUMP (внизу). За наявності FdUMP перші  і  етапи реакції протікають нормально, але у результаті утворюється стабільний комплекс, який складається з FdUMP, ковалентно зв’язаного з ензимом і тетрагідрофолатом, що інактивує ензим. Механізм дії тимідилатсинтази

N ⁵,N ¹⁰-Метилен-Н₄-фолат

переміщення 1,3 гідриду Ензим + дигідрофолат

Інактивація ензиму внаслідок утворення ковалентного комплексу