2.3.9. Визначення амінокислотного складу.

1. Підготовка зразків до аналізу

Має велике значення і є першою передумовою для одержання достовірних і відтворених результатів при роботі на автоматичному аналізаторі амінокислот правильно обраний спосіб підготування зразка. Процес підготування зразків можна розділити на виділення амінокислот, зв'язаних у білках, пептидах, що потребують гідролізу, і на підготування зразків, що містять вільні амінокислоти (біологічні рідини, тканинні екстракти), із яких усувають білки й інші речовини, що заважають аналізу.

Найбільш часто застосовується метод гідролізу хлористоводневою (соляною) кислотою. Гідроліз проводять таким чином:

На дні пробірки з вогнетривкого скла (пірекс) розміщають ретельно зважений зразок з вмістом сухого білки біля 2 мг або еквівалентна кількість водяного розчину білка. До сухої наважки білка в пробірку додають 0.5 мл дистильованої води і 0,5 мл концентрованої хлористоводневої кислоти. До водяного розчину білка добавляють рівну кількість концентрованої хлористоводневої кислоти. Пробірку охолоджують у суміші сухого льоду з ацетоном або рідкого азоту. Після того, як вміст пробірки замерзне, із неї відкачують повітря за допомогою вакуумного насосу для запобігання окислювання амінокислот у результаті гідролізу. Потім пробірку запаюють. Запаяну пробірку ставлять на 24 години в термостат із постійною температурою +106° С. По закінченню гідролізу пробірку розкривають, попередньо охолодив до кімнатної температури. Вміст кількісно переносять у скляний бюкс і розміщають у вакуум - ексикатор над гранульованим їдким натрієм. Потім із ексикатора видаляють повітря за допомогою водоструменевого насосу. Після висушування зразка, у бюксу додають 3-4 мл деіонізованної води і повторюють процедуру висушування. Можливо також видалення соляної кислоти на водяній бані під витяжкою. Підготовлений у такий спосіб зразок розчиняють у 0,3- нормальному літій цитратному буфері рН 2,2 і наносять на іонообмінну колонку аналізатора амінокислот.

Для визначення триптофану застосовується лужний гідроліз, що не можна застосовувати для визначення інших амінокислот, тому що при лужному гідролізі ряд амінокислот перетерплюють зміни.

2. Принцип роботи амінокислотного аналізатора

Принцип роботи полягає в тому, що елюент із ємкості за допомогою насосу , що дозує , проганяється через хроматографічну колонку. На виході з колонки до елюату мікронасосом безупинно підкачується нінгідриновий реактив у визначеному співвідношенні з елюатом. Суміш елюата і нінгідринового реактиву по капілярній трубці направляється в реактор, що нагрівається до температури 95-98°С і потім направляється в проточну кювету. Інтенсивність фарбування, що з'явилося, вимірюється фотоколориметрируванням за допомогою фотоелементу, на який світло від джерела проходить через стінки кювети. Сигнали фотоелемента підсилюються і реєструються самописним потенціометром у вигляді хроматограми. Площа піків на хроматограмі підраховується і порівнюється з площею піків амінокислот з відомою концентрацією. З порівняння цих площ робиться обчислення абсолютної кількості амінокислоти в аналізованому зразку.