Задание 4. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии ддс-Na

Принцип метода: Диск-электрофорез представляет собой метод разделения, в котором используется неоднородная («прерывистая») разделяющая система с полиакриламидным гелем в качестве носителя. При диск-электрофорезе применяют пары буферов разного состава и с разными значениями рН, а носитель состоит из отдельных слоев геля, отличающихся друг от друга по размерам пор. Благодаря этому разделяемые вещества концентрируются сначала в очень узкой стартовой зоне в полосе крупнопористого геля, что имеет решающее значение для четкого разделения в мелкопористом геле по величине, форме и заряду молекул. Таким образом, высокая разрешающая способность диск-электрофореза базируется на двух физических явлениях: эффекте концентрирования и эффекте молекулярного сита. Диск-электрофорез в ПААГ с ДДС-Na позволяет фракционировать белки в зависимости от значений только одного параметра – их молекулярной массы. Сравнивая ЭФ-подвижность полипептидов образца с подвижностью белков-маркеров с известной молекулярной массой можно определить молекулярную массу анализируемых полипептидов. С этой целью строят график зависимости десятичного логарифма молекулярной массы от относительной электрофоретической подвижности R_f для белков маркеров. Определив теперь R_f интересующего нас полипептида, на графике можно найти для него величину lgM и подсчитать молекулярную массу.

Практические указания:

С помощью диск-электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na по методу Лэммли (Laemmli, 1970) получить электрофоретический спектр анализируемых проб, содержащих хромосомальные белки (гистоны и негистоновые белки), охарактеризовать их в сравнении с ЭФ-спектром белков-маркеров с известными молекулярными весами.

Необходимое оборудование:

1. Камера Mini-protean^®3 cell (фирма Bio-Rad)

2. Источник питания PowerPac Basic или PowerPac HC, фирмы «Bio-Rad»

3. Шейкер – UltraRocker Rocking Platform фирмы Bio-Rad

4. Система для визуализации и регистрации результатов электрофореза – система гель-документирования высокого разрешения ChemiDoc XRS фирмы «Bio-Rad»

5. Шприц «Гамильтон» для нанесения проб или механический дозатор (0,2 – 10 мкл) со сменными пластмассовыми наконечниками для нанесения проб на ПААГ.

Необходимые реактивы:

1) Раствор для приготовления разделяющего геля: 15%-ный акриламид – 0,4%-ный N,N′-метиленбисакриламид на буфере 0,1%-ный ДДС-Na – 0,375 М трис-HCl, рН 8,8. Непосредственно перед формированием геля к этому раствору добавляют ТЕМЕД и персульфат аммония (ПСА) до конечной концентрации 0,025%.

2) Раствор для приготовления концентрирующего геля: 3%-ный акриламид – 0,16%-ный N,N′-метиленбисакриламид на буфере 0,1%-ный ДДС-Na – 0,125 М трис-HCl, рН 6,8. Непосредственно перед формированием геля к этому раствору добавляют ТЕМЕД и ПСА до конечной концентрации 0,05%.

3) Электродный буфер: 0,1%-ный ДДС-Na – 0,192 М глицин – 0,025 М трис, рН 8,3.

4) Раствор для приготовления пробы: Перед электрофорезом к каждой пробе добавляют равный объем раствора для проб: 4%-ный ДДС-Na – 10%-ный 2-β-меркаптоэтанол – 0,25 М трис-HCl, рН 6,8. Смесь инкубируют на кипящей водяной бане в течение 1,5-2 мин, охлаждают и уплотняют кристаллической сахарозой до конечной концентрации 9%-ов. Кроме того, к пробе добавляют лидирующей краситель бромфеноловый синий до конечной концентрации 0,01%.

5) Растворы 10%-ного ТЕМЕД и 10%-ного ПСА (!свежеприготовленный)

6) Раствор для фиксации полиакриламидного геля – 50%-ный этанол

7) Раствор для окрашивания белков в ПААГ – 0,125%-ный Кумасси G-250 на 40%-ном этаноле

8) Раствор для отмывки и хранения геля – 7%-ная уксусная кислота

Ход работы: