Ход реакции Денатурация днк

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называетсяотжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60-72 °C.

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин [3].

Рис. 1: Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается [1].

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2ⁿ — 2n, где n — число циклов реакции^[15]. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)ⁿ, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато» [3].

Практическая часть Подбор праймеров

Ход работы

1. Была найдена информация о первичной структуре гена НАДН-дегидрогеназы гадюки обыкновенной на сайте US NationalLibraryofMedicine, в базе GenBank(http://www.pubmed.com), по которой можно подобрать праймеры для ПЦР-амплификации этого гена у других видов гадюк.

2. Ввели в поисковую строку латинское название организма и интересующий ген (Viperaberus NADH dehydrogenase).

3. Выбрали вкладку «Nucleotide» .

4. Информацию скопировали в файл. Один из сиквенсов (англ. sequence– последовательность) для примера приведѐн на рис. 1.

5. Были подобраны праймеры для ПЦР, прямой и обратный. Для прямого праймера достаточно выбрать короткий отрезок гена вблизи его 5’-конца с оптимальной длиной около 20 нуклеотидов. Для подбора обратного праймера нужно восстанавливать комплементарную цепь ДНК. Любую нуклеотидную последовательность записывают в направлении 5’→3’.

6. Расcчитали температуру отжига праймеров.

Рис.2. Ген НАДН-дегидрогеназы гадюки обыкновенной V.berus [4].

LOCUS AY321075 1007 bp DNA linear VRT 04-MAR-2005

DEFINITION ViperaberusNADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene, partial cds; mitochondrial gene for mitochondrial product.

ACCESSION AY321075

VERSION AY321075.1 GI:36938860

SOURCE mitochondrion Viperaberus39

ORGANISM Viperaberus

Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;

Lepidosauria; Squamata; Scleroglossa; Serpentes; Colubroidea;

Viperidae; Viperinae; Vipera.

REFERENCE 1 (bases 1 to 1007)

AUTHORS Garrigues,T., Dauga,C., Ferquel,E., Choumet,V.R. and Failloux,A.

TITLE Molecular phylogeny of Vipera and related genus

JOURNAL Unpublished

REFERENCE 2 (bases 1 to 1007)

AUTHORS Garrigues,T. and Dauga,C.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (01-JUN-2003) IMI, Institut Pasteur, Paris, France

/organism=«Viperaberus» /organelle=«mitochondrion»

gene<1..>1007

/gene=«ND2»

CDS <1..>1007

/gene=«ND2»

/codon_start=2

/transl_table=2

/product=«NADH dehydrogenase subunit 2»

/protein_id=«AAQ86880.1«

translation=«PMSWITITISIFMTTTLITMTTHWLMAWTCLEINTLSMIPVISK

TNHPRATEATTKYFLTQTLASITILSMTTLNALNTSNWEINLTTESTTMKIITLALMM

KMAAAPFHFWLPEVAQGATTLTALTILTWQKIAPLAILLATHNNTNLTILSSSAILSV

LVGGLGGLNQTQLRKLMAFSSIAHTGWILATITLAPNISTLTFMIYTMTTMPIFLILN

LSSSATIKDMGTLWTTSPYFMMTMLLTILSLTGLPPLTGFMPKWLILNKMVTFNMTLE

ATLMAMSSLPSLYLYMRLTYTMAMTIPPHPSLMPMKWRTTHKNNTILPLTLSTMMILLC»

ORIGIN

1 tcccatatcctgaattacaatcaccattagcattttcatgaccaccaccttaattaccat

61 aacaacacactgactcatagcatgaacatgtctggaaatcaatactttatctataatccc

121 agttatctctaaaactaatcacccccgggcgacagaagcaacaacaaaatacttcctcac

181 acaaaccctagcctccatcaccatcctatctataacaacactaaatgcacttaatacctc

241 caactgagagattaacctaacaacagaatcaacaacaataaaaattattaccctagcact

301 aataataaaaatagctgcagcaccattccacttttgattaccagaagtagcgcaaggcgc

361 cacaacactaactgccctaaccatccttacctgacaaaaaattgcccccctcgccatcct

421 attagccacccataacaacacaaaccttacaatcctaagctcatcagctatcctatctgt

481 cttagtcggtggccttggaggcctcaatcaaactcaactacgaaaactaatagctttttc

541 atcaatcgctcacactggctgaatcttagctactattactctagccccaaatatttcaac

601 ccttaccttcataatctatacaataaccacaatacccatctttcttattctcaacctttc

661 atcgtcagcaacaattaaagacataggaactttatgaaccacttctccctactttataat

721 aaccatacttctaaccatcttatccctcacagggctgcccccacttacagggtttatacc

781 aaaatgacttatcctaaataaaatagttaccttcaacataaccctagaagccaccctaat

841 ggccatatcctcccttccaagcctgtacctttatatacgcctaacatataccatagccat

901 aactatcccaccccacccctcacttataccgataaaatgacgaacaacccataaaaacaa

961 cactatcttacccctcactctatcaacaataataattcttctctgcc

Правила подбора праймеров

- Размер праймера должен составлять 16–25(30) нуклеотидов.

- СG-состав должен лежать в пределах 50–60 %.

- Разница в температуре отжига обоих праймеров – не более 6С.

- Праймеры не должны быть само- и взаимно- комплементарными.

- Нуклеотиды 3’-конца праймера должны быть строго комплементарны матрице (замены возможны на 5’-конце длинных праймеров ).

Расчѐт температуры отжига праймера

Для точногорасчѐта оптимальной температуры существует множество программ и алгоритмов. Упрощенныйрасчѐт можно провести по формулам:

Tа= [(A+T)2°C]+[(G+C)4°C] (если длина ≤ 20 оснований)

Tа= 22+1,46 ([2(G+C)]+(A+T)] (если длина составляет 20–30 оснований) [3].