3. Визначення концентрації гемоглобіну

Для визначення гемоглобіну в крові запропоновано ряд методів, серед яких найбільшого поширення набули колориметричні методи, які базуються на колориметрії похідних гемоглобіну. Найбільш простим і широко розповсюдженим в минулому була колориметрія солянокислого гематину, на чому оснований метод Салі. Цей метод простий і швидко виконується, проте дає похибку біля ±30%, тому зараз його використовують все рідше. В якості уніфікованого зараз запропонований глобінціанідний метод з використанням ацетонціянгідрину.

Принцип: гемоглобін окислюють в метгемоглобін (геміглобін) залізосиньородистим калієм (червоною кров’яною сіллю). Ця сполука взаємодіє з ацетонціангідрином з утворенням ціанметгемоглобіну (геміглобінціаніду), який визначають колориметрично.

Реактиви:

1 – трансформуючий розчин (ацетонціангідрин) – 0,5 мг. Калій залізосиньородистий 0,2 г, натрію гідрокарбонат – 1г, дистильована вода – до 1 л.

2 – калібрувальний розчин гемоглобінціаніду з концентрацією 61,23мг/100мл, або 59,75мг/100мл, що відповідає концентрації гемоглобіну 154г/л чи 150 г/л при розведенні в 251 раз.

Хід визначення: в пробірку до 5 мл трансформуючого розчину добавляють 0,02 мл крові (розв. в 251 раз). Вміст пробірки перемішують, залишають стояти на 10 хв. Паралельно це ж роблять із стандартним розчином. Екстинцію вимірюють на ФЕКу через 20 хв при довжині хвилі 500-560 нм (зелений фільтр) в кюветі 1см, порівнюючи з дистильованою водою на спектрофотометрі. Розрахунок проводять за формулою:

Hb (г/л) = (Ед/Ест)∙С∙К∙0,01, де С – концентрація гемоглобінціаніду в стандартному розчині, К – коефіцієнт розведення крові, 0,01 – коефіцієнт перерахунку мг/100мл в г/л.

4. Колориметричний динітрофенілгідразиновий метод визначення активності амінотрансфераз в сироватці крові (за Ратманом-Френкелем)

Принцип: у результаті переамінування, що відбувається під дією АсАТ і АлАТ, утворюються щавелоотцтова і піровиноградна кислоти. Щавелоотцтова кислота здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися на піровиноградну кислоту. При додаванні кислого 2,4-дінітрофенілгідразину ензиматичний процес зупиняється і виходить гідразон піровиноградної кислоти. Останній у лужному середовищі дає фарбування, інтенсивність якого пропорційна кількості піровиноградної кислоти, яка утворилася.

Реактиви:

1. 0,1 моль / л фосфатного буфера, рН 7,4. Для приготування буферного розчину змішують 840 мл 0,1 моль/л розчину двозаміщенного фосфату натрію Na₂HP0₄×2H₂0 (17,4 г кристалічної солі розчиняють в 1 л дистильованої води; двозаміщений фосфорнокислий натрій, що містить дві молекули води, отримують шляхом вивітрювання на повітрі протягом двох діб кристалічної солі, яка містить зазвичай 12 молекул води, (сіль попередньо розтирають у ступці в порошок) і 160 мл 0,1 моль/л розчину безводного однозаміщеного фосфату калію КН₂РО₄ (13,6 г КН₂РО₄ розчиняють в 1 л дистильованої води).

Буферний розчин з індикатором бром-тимоловим-синім (реактив 2) повинен давати блакитне забарвлення. В якості консерванту до нього можна додати 5-10 мл хлороформу.

2. Розчин бром-тимолового-синього - 0,04 г/100 мл 100 мг індикатора розчиняють у ступці з 3,2 мл 0,05 н розчину їдкого натру. Потім суміш змивають водою у мірну колбу ємністю 250 мл і доводять водою до мітки.

3. Субстратний розчин для визначення аспартатамінотрансферази. 29,2 мг α-кетоглутарової і 2,66 г DL-аспарагінової кислот (при використанні замість DL-аспарагінової кислоти L-аспарагінової, а замість DL-аланіну - L-аланіну міру субстрату слід зменшити вдвічі) відважують на аналітичних вагах і вносять у 1 н розчин NaOH. Їдкий натр доливають обережно, невеликими порціями до повного зникнення осаду і до отримання суміші з рН 7,4 (для визначення рН використовують універсальний індикаторний папір або застосовують рН-метр). Розчин переливають в мірну колбу ємністю 100 мл, ополіскують посуд 0,1 ммоль/л фосфатним буфером (рН 7,4) і доводять ним обсяг колби до мітки. Буферний розчин ретельно перемішують, додають 1 краплю хлороформу, розливають у флакончики з-під пеніциліну і зберігають у холодильнику в замороженому стані. Перед вживанням заморожений розчин слід повністю розморозити.

4. Субстратний розчин аланінамінотрансферази для визначення активності. 29,2 мг а-кетоглутарової кислоти та 1,78 г DL-аланіну (0,89 г L-аланіну) відважують на аналітичних вагах. Далі все виконується за вказівками для першого субстратного розчину (реактив 3).

5. Розчин 2,4-дінітрофенілгідразіна. 19,8мг 2,4-дінітрофенілгідразіна розчиняють у невеликій кількості 1 н розчину соляної кислоти при нагріванні суміші на водяній бані. Після того, як розчин остигне, доводять його обсяг соляною кислотою до 100 мл. На наступний день реактив фільтрують. Розчин зберігають у посуді з темного скла в холодильнику. Придатний протягом року.

6. 0,4 н NaOH, вільний від карбонатів. Реактив можна приготувати з сильно концентрованого розчину NaOH (50 г/100 мл), розбавляючи його свіжокип'яченою водою , вільною від карбонатів, до отримання суміші з щільністю 1,016 кг/л при +20 ° С або 1,018 кг/л при +15 ° С. Однак переважно готують реактив з фіксаналу. Судини з реактивом і дистильованої водою закривають пробками з поглинальними трубками, наповненими натронним вапном або гідроокисом барію.

7. Стандартний розчин піровинограднокислого натрію CHaCOCOONa. 11 мг точно зваженого кристалічного піруватого натрію (білого кольору) розчиняють у невеликій кількості дистильованої води, переносять в мірну колбу ємністю 100 мл і доводять об'єм дистильованою водою до мітки; 1,0 мл розчину містить ПЗ мкг піруватого натрію, що відповідає 88 мкг піровиноградної кислоті. Розчин використовують для побудови калібрувального графіка.