Аминокислоты, образующие области взаимодействия в белке DsRedl, и их консервативность или вариабельность

в других GFP-подобных белках (Verkhusha, Lukyanov, 2004)

hcriCP

DsRed1

mRFP1

Положение аминокислот^а

dstrGFP amajGFP zoanGFP zoanYFP zoanRFP rfloRFP mcavRFP asulCP

S

• I

N

V

V

• E K K

E

K

S

^Q

I

R

R

K

• E W F P C S A L P H I

K

S

• I

N

N

M

• E I

K

E

K

S

^Q

M

R

R

K

• E W F A C S A L A H I

K

S

• I S

Y

• I E T K

E

S

S

^Q

I

R

R

K

• E W F P C S A L P H I

K

S

I

T

R

D

• T E R N

E

R

N

D

• H R K A E

• F P T G L P R H E S

V

• T T I

I

E

K

E

E

R

H

E

• H L R A E

Y

• A T H L F L R E K

V

• T T R T T E K E

E

E

K

E

• H D R R E A K A T S T G A R E K

T

• T S H

S D T

V

E

C

T

^Q

T

N

R

K

F

D

N

• P F T S

• F H

• R

T

• T T M A I

H P

E

C

A

D

F

H

R

I

S

E

• F P T S P L ^Q G

• C

T

F

T

H

L

N

T

E

K

Y

E

• L H

• H T I

A

E

F

F

P

T

C

D

A

A

A

• R

T

I

T

H

L

T

S

E

K

V

E

E

• H

R I

A E F F P T S D L P A

R

S

L

C

T

T

L

• E K

Y

E

R

H

D

• H

• R A E

Y

• P T H P F

Q

I

• K

97

105

107

109

126

128

184

19

124

26

101

157

166

180

153

176

178

151

168

146. 198

200

149

229

230

231

229. 223 225 204

1 Взаимодействие между остатками соседних мономеров показано стрелками.

образуют гомо-, а не гетеротетрамеры. Кроме того, мето­дами флуоресцентной микроскопии живых кораллов было показано, что FPs разного цвета обычно экспресси­руются в разных клетках организма. Поэтому считается, что вероятность встретить в природе гетеротетрамерный FPs очень низка (Wall et al., 2000).

При физиологических условиях флуоресцентные белки дикого типа из биолюминесцентных организмов, в том числе из Aequorea и Renilla, способны образовывать гетеротетрамеры с соответствующими фотобелками (FP₂ X фотобелок₂). Это наблюдение вместе с анализом пространственной структуры GFP-подобных белков по­зволяет предположить, что функции гидрофильной и гидрофобной областей взаимодействия различны. Одна из этих областей обычно участвует в образовании гомо­димеров, в то время как функция другой области изменя­лась в ходе эволюции. В белках у биолюминесцентных видов эта область ответственна за связывание акворина или люциферазы, а у небиолюминесцентных связывает второй гомодимер GFP-подобного белка.

Информация о трехмерной структуре DsRed1 и ами­нокислотах, входящих в области взаимодействия, оказа­лась полезной при создании мутантных неолигомерных форм FPs. Генноинженерными методами было показано, что формирование тетрамеров является очень важным этапом при созревании FPs. Единичные аминокислотные замены в областях взаимодействия DsRed1 приводили к резкому уменьшению интенсивности флуоресценции и скорости созревания белка (Campbell et al., 2002). Потеря способности образовывать тетрамеры по-разному сказы­вается на флуоресцентных свойствах различных FPs из Anthozoa. Так например, флуоресцентный мутант hcriCP удалось перевести из тетрамерной формы в димерную при помощи единичной аминокислотной замены Leu126 на His в гидрофобной области взаимодействия, и при этом не наблюдали существенного уменьшения свече­ния. Аминокислотная замена в том же самом положении (Ile126 на Arg) в DsRed1 также переводит белок в димер­ную форму, но при этом практически полностью утрачи­вается способность к флуоресценции (Campbell et al.

,

Рис. 7. Четвертичная структура красного флуоресцентного белка DsRed1 (Verkhusha et al., 2003).

а

Рис. 8. Схема механизма образования хромофора GFP (по: Heim et al., 1994, с изменениями).

— структура тетрамера; мономеры показаны разным цветом; в центре каждого мономера расположен хромофор, атомы которого показаны се­рым (углерод), синим (азот) и красным (кислород) цветами; б — показа­но, что структура мономера DsRed1 в отличие от мономера GFP из Aequ­orea не вписывается в окружность (штриховая линия), что свидетельст­вует о деформации Р-бочонка. Рисунки получены с помощью программы Rasmol. Публикуется с любезного разрешения авторов.

2001. . Для того чтобы димерная форма сохранила спо­собность к флуоресценции, потребовалось введение до­полнительных мутаций. Мономерная флуоресцирующая мутантная форма mRFP1 отличается от DsRed1 33 ами­нокислотными заменами.

Структура мономера DsRed1 очень сходна со струк­турой GFP из Aequorea (рис. 7) и представляет собой Р-бочонок (Р - can). Однако мономерные субъединицы DsRed1 заметно деформированы. В отличие от GFP, ко­торый при рассмотрении сверху имеет форму круга, мо­номер DsRed1 имеет овальную форму. Подобная дефор­мация непосредственно влияет на микроокружение хро­мофора и, возможно, имеет значение при созревании белка. Этим можно объяснить потерю флуоресцентных свойств при аминокислотных заменах в областях взаи­модействия.

М

Константы скоростей рассчитаны для мутантной формы GFP, содержа­щей замену Ser65 на Thr (Heim et al., 1995; Reid, Flynn, 1997).

еханизмы образования хромофора. Уни­кальной особенностью GFP из Aequorea является то, что входящий в состав белка хромофор представляет собой не внешнюю простатическую группу (как, например, гем в гемоглобине), а образуется из остатков цепи Ser65—

Tyr66—Gly67 путем реакции автокаталитической цикли­зации между остатками Ser и Gly (Cody et al., 1993; Ormo et al., 1996), входящими в состав внутренней a-спирали (рис. 8). Хотя подобная аминокислотная последователь­ность встречается и в других белках, в них хромофор не образуется, что свидетельствует о решающей роли про­странственной структуры белка в образовании зеленого хромофора. После процесса циклизации промежуточный продукт подвергается дегидрированию (отщепление ато­мов водорода происходит по C_a—Cp-связи Tyr66) при помощи молекулярного кислорода, в результате чего и возникает зрелый хромофор (4-(p-гидроксибензили- ден)-имидазолид-5-он). Хромофор имеет плоское строе­ние и состоит из двух ароматических колец и мостика между ними. Одним из ароматических колец является бензольное кольцо Tyr66, а другим — пятичленный гете­роцикл. Таким образом, хромофор представляет собой систему сопряженных двойных связей, которая способна поглощать УФ и синий свет и излучать флуоресценцию в зеленой области спектра. Жесткое микроокружение и высокая плотность упаковки ядра GFP, по-видимому, обеспечивают хромофору высокий квантовый выход флуоресценции.

В GFP-подобных белках из Anthozoa было обнаруже­но большое разнообразие структур хромофора (рис. 9). В частности, изучение хромофора DsRed1 привело к по­явлению гипотезы о том, что красные флуоресцентные белки содержат химически отличные от GFP поглощаю­щие структуры (Matz et al., 1999). Действительно, значи­тельный длинноволновый сдвиг спектра вряд ли можно объяснить только особенностями микроокружения хро­мофора. Вскоре была предложена структура хромофора DsRed1 (Gross et al., 2000). Аминокислотами, образую­щими хромофор в DsRed1, являются Gln65—Tyr66— Gly67. Было показано, что спектральные свойства белка объясняются расширением системы двойных связей за счет дополнительной реакции дегидрирования связи C_a—N Gln65 (рис. 10, а). Кристаллографический анализ белка позволил окончательно подтвердить структур

у

Рис. 9. Виды хромофоров, встречающиеся в GFP-подобных белках (Vekhusha, Lukyanov, 2004).

а — GFP из Aequorea victoria; б — красный флуоресцентный белок DsRed из Discosoma; в — нефлуоресцентный хромопротеин Rtms5 из Montipora; г — флуоресцентный белок eqFP611 из Entacmaea с максимумом спектра поглощения в дальней красной области. Публикуется с любезного разре­шения авторов.

хромофора DsRedl (рис. 9, б), так как было показано из­менение тетраэдрической геометрии а-углерода Gln65 на плоскую (Yarbrough et al., 2001). Кроме того, химиче­ский синтез соединений, похожих по структуре на хро­мофор DsRedl, показал, что введение дополнительной двойной связи в GFP-подобный хромофор приводит к за­метному красному сдвигу спектра (He et al., 2002).

Б

Рис. 10. Структура хромофора DsRed1 и его микроокружение (а—г) (Verkhusha et al., 2003).

ыл предложен следующий механизм образования хромофора DsRedl: на первом этапе происходит образо­вание анионной формы GFP-подобного хромофора (с максимумом спектра поглощения при 480 нм и максиму­мом спектра флуоресценции при 500 нм), который под­вергается окислению, вследствие чего образуется зрелый красный хромофор (с максимумом спектра поглощения при 558 нм и максимумом спектра флуоресценции при 583 нм). Такая схема образования хромофора была пред­ложена на основании следующих наблюдений: во-пер­вых, дикий тип DsRedl и многие его мутантные формы содержат молекулы, флуоресцирующие в зеленой облас­ти (Baird et al., 2000; Wiehler et al., 2001); во-вторых, в процессе созревания хромофора зеленая флуоресценция появляется раньше красной, а затем постепенно умень­шается с той же скоростью, с какой растет красная флуо­ресценция; в-третьих, химическая структура красного хромофора представляет собой GFP-подобное ядро с расширенной системой сопряженных л-связей.

О

Атомы углерода, азота и кислорода показаны серым, синим и красным цветами соответственно. Рисунки получены с по­мощью программы Rasmol. Публикуется с любезного разреше­ния авторов.

днако между зеленым и красным мономерами в тетрамере DsRed1 может существовать эффективный пе­ренос энергии. Поэтому уменьшение зеленой флуорес­ценции в процессе созревания хромофора может быть вызвано как химической трансформацией зеленого хро­мофора в красный, так и переносом энергии от зеленого к созревающему позже красному хромофору. Чтобы вы­яснить, какое из этих двух предположений верно, необ­ходимо измерять спектры поглощения, так как спектры флуоресценции в данном случае не отражают истинного количества каждой спектральной формы (Wiehler et al.,

2001. . Первый анализ спектров поглощения в процессе созревания хромофора DsRed1 показал, что спектр по­глощения только что синтезированного DsRed1 имеет минорную синюю полосу поглощения с максимумом при 408 нм, которая не представлена в спектре зрелого белка (Wiehler et al., 2001). За появление этой полосы в спектрах поглощения отвечает нейтральная форма GFP-подобного хромофора. Кроме того, было показано постоянное увеличение интенсивности полосы поглоще­ния при 480 нм на протяжении всего времени созрева­ния. К сожалению, основываясь на ошибочной норми­ровке всех спектров по отношению к интенсивности по­глощения в красной области спектра (558 нм), авторы сделали ошибочное заключение об относительном умень­шении зеленого поглощения в процессе созревания хро­мофора DsRed1 (Wiehler et al., 2001).

Последние данные (Verkhusha et al., 2004) свидетель­ствуют о необходимости пересмотра схемы созревания хромофора DsRed1. Анализ кривых поглощения на раз­ных стадиях созревания некоторых красных белков по­казал следующее: 1) полоса поглощения с максимумом при 408 нм (синий пик) появляется первой, в течение не­которого времени растет, после чего падает до нуля; 2) полоса поглощения с максимумом при 480 нм (зеле­ный пик) появляется позже и растет на протяжении всего времени созревания хромофора; 3) красная полоса с мак­симумом при 558 нм появляется еще позже и также все время растет; 4) уменьшение синего пика строго корре­лирует с ростом красного (рис. 11). Эти данные позволи­ли заключить, что образование красного хромофора про­ходит через стадию образования нейтральной формы GFP-подобного хромофора, в то время как анионная форма GFP-подобного хромофора не является промежу­точным состоянием, как это предполагалось раньше (Ba­ird et al., 2000). Данная схема объясняет не очень понят­ный ранее факт наличия в зрелом DsRed и во многих его мутантных формах зеленых хромофоров

.

Впервые пространственная структура хромофора белков, относящихся к классу хромопротеинов, была определена для Rtms5 из кораллов Montipora efflorescens (Prescott et al., 2003). Было показано, что Rtms5 содержит DsRed-подобный хромофор в необычной trans-конфор­мации (хромофор в DsRed и GFP из Aequorea victoria находится в cis-конформации) и имеет неплоское строе­ние (рис. 9, в). Красный флуоресцентный белок eqFP611 из морской актинии Entacmaea quadricolor тоже содер­жит DsRed-подобный хромофор в trans-конформации (Petersen et al., 2003), однако в противоположность Rtms5 имеет плоское строение (рис. 9, г). На основании этих данных можно предположить, что плоское строение хромофора определяет высокий квантовый выход флуо­ресценции белка, в то время как неплоское строение хро­мофора в trans-конформации характерно для хромопро­теинов. Данное предположение было подтверждено при определении пространственной структуры «разжигае­мого» флуоресцентного белка asulCP из морской акти­нии Anemonia sulcata в нефлуоресцентном состоянии. Было показано, что хромофором в asulCP является p-гид- роксибензилиден-имидазолидон, который имеет неплос­кое строение и находится в trans-конформации. Кроме того, после реакции циклизации полипептидная цепь asulCP подвергается расщеплению между атомом C остатка Cys62 и атомом N1 остатка Met63 (Wilmann et al., 2005).

Еще один флуоресцентный белок, желтый zoanYFP из полипов Zoanthus sp., содержит хромофор, образован­ный тремя циклическими структурами. Зрелый хромо­фор zoanYFP формируется из аминокислотной последо­вательности Lys66—Tyr67—Gly68. На первых этапах со­зревания образуется структура, сходная с хромофором GFP, после чего в результате реакции циклизации Lys66 формируется шестичленный гетероцикл. Как и в случае asulCP, на последнем этапе созревания полипептидная цепь zoanYFP подвергается расщеплению между остат­ками в положениях 65 и 66 (Remington et al., 2005).

Микроокружение хромофора. На спектраль­ные свойства FPs существенное влияние оказывают не­ковалентные взаимодействия между хромофором и бо­ковыми цепями остатков микроокружения хромофора. Влияние микроокружения хромофора на его спектраль­ные свойства подтверждено на мутантных формах GFP из Aequorea (Remington, 2000) и различных GFP-подоб­ных белков из класса Anthozoa.

Микроокружение хромофора DsRedl содержит мно­го полярных аминокислот, сложную сеть водородных связей и солевых мостиков. Атом O остатка Tyr66 обра­зует водородную связь с Ser148 (рис. 10, б), который яв­ляется строго консервативным во всех FPs из Anthozoa, но отсутствует в CPs. По-видимому, взаимодействие между Ser148 и Tyr66 стабилизирует хромофор в состоя­нии, способном к флуоресценции. Генноинженерные ис­следования подтвердили, что Ser148 является ключевым остатком при взаимном переходе между FPs и CPs (Lu­kyanov et al., 2000; Bulina et al., 2002). Так, белок asCP из Anemonia sulcata с квантовым выходом менее 0.001 име­ет в данном положении Ala, замена которого на Ser при­водит к увеличению квантового выхода более чем в 2 раза.

Несмотря на близкое расположение остатков Ser203 и Tyr66 в DsRed1, они в противоположность остаткам Thr203 и Tyr66 в Aequorea GFP не образуют водородной связи (Ormo et al., 1996). Однако замены в положении

Рис. 11. Временная зависимость образования синей, зеленой и красной форм хромофора DsRed1 с максимумами поглощения при длинах волн 408, 480 и 558 нм соответственно (верхняя па­нель) и предложенная схема образования данных спектральных форм из предшественника, не обладающего флуоресцентными свойствами (нижняя панель) (по: Verkhusha et al., 2004, с изме­нениями).

203 приводят к существенным изменениям спектраль­ных характеристик DsRed1. При замене Ser203 на Ala скорость созревания белка увеличивается (Terskikh et al., 2002). Замена Ser203 на Thr существенно увеличивает зеленую флуоресценцию в незрелом белке, в то время как замена Ser203 на Tyr частично подавляет зеленое из­лучение и увеличивает эффективность сворачивания белка (Verkhusha et al., 2001b).

Особого внимания заслуживает роль остатка в поло­жении 165. В DsRe1 Ile165 расположен в плоскости хро­мофора, в непосредственной близости от фенольного кольца Tyr66 (рис. 10, б), такое же положение занимает и Phe165 в GFP (Ormo et al., 1996). Данные аминокислоты должны препятствовать cis—trans-изомеризации хромо­фора, которая, как полагают, является главной причиной безызлучательной дезактивации возбужденного состоя­ния хромофора (Niwa et al., 1996; Weber et al., 1999). Действительно, во всех FPs в положении 165 локализо­ваны массивные алифатические аминокислоты (Phe, Ile и Val), а в CPs — маленькие гидрофильные остатки (Asn или Ser). При помощи мутагенеза была подтверждена значимость подобных различий. Например, замена Ser165 на Val в asulCP привела к появлению заметной красной флуоресценции, в то время как замена Ile165 на Asn существенна для перевода DsRed1 в нефлуоресцент­ное состояние (Bulina et al., 2002).

Интересной особенностью DsRed1 является непо­средственное взаимодействие атома O Tyr66 и положи­тельно заряженного Lys167 (рис. 10, б). Ни один из изве­стных FPs, включая близко гомологичный красный dis2RFP, не содержит Lys в этом положении. Случайный мутагенез DsRed1 показал, что флуоресцентные свойст­ва белка сохраняются при замене Lys167 на Gln или на Met (Campbell et al., 2002). Однако в комбинации с заме­нами по положениям 148, 165 и 203 замена Lys167 на

Met приводит к значительному уменьшению квантового выхода белка. Таким образом, данный ионный контакт, по-видимому, не является определяющим в формирова­нии флуоресцентных свойств, но, вероятно, обеспечива­ет дополнительную стабилизацию хромофора в ионизи­рованном состоянии за счет взаимодействия с Tyr66.

На основании представленных выше данных был со­здан мутант DsRed-NF, который содержит четыре ами­нокислотные замены: Ser148 на Cys, Ile165 на Gln, Lys167 на Met и Ser203 на Ala (Bulina et al., 2002). DsRed-NF имеет высокий коэффициент экстинкции (57-10³ М ¹ см ¹) и чрезвычайно низкий квантовый вы­ход (менее 0.001). Данные спектральные характеристики позволяют рассматривать DsRed-NF как истинный хро­мопротеин. Компьютерное моделирование микроокру­жения хромофора DsRed-NF показало, что остатки Cys148 и Met167 в DsRed-NF в отличие от остатков Ser148 и Lys167 в DsRed не способны стабилизировать хромофор путем взаимодействия с Tyr66; кроме того, за­мена Ile165 на Gln приводит к образованию свободного пространства рядом с хромофором, которое, как полага­ют, достаточно для обеспечения его cis—trans-изомери­зации после поглощения света. Таким образом, отсутст­вие стабилизирующего взаимодействия с Tyr66 наряду с наличием свободного пространства рядом с хромофором может объяснить чрезвычайно низкий квантовый выход флуоресценции DsRed-NF.

В микроокружение хромофора DsRed1 входят также Arg96, Lys69 и Glu222 (рис. 10, в). Остаток Arg96 при­сутствует во всех GFP-подобных белках и находится в непосредственной близости от кислорода имидазолино- на. Возможно, Arg96 участвует в процессе циклизации при образовании хромофора. Эволюционно консерва­тивный остаток Glu222 располагается ближе к хромофо­ру в DsRed1, чем в GFP. Предполагают, что правильное расположение Glu222 играет важную роль при образова­нии красного хромофора (Yarbrough et al., 2001). Оста­ток Glu222 в DsRed1, кроме того, взаимодействует с мо­лекулой воды, расположенной рядом с остатками Gln65 и с положительно заряженным Lys69. Во всех GFP-по­добных белках Anthozoa в положении 69 находится либо Arg, либо Lys. По-видимому, положительный заряд этих остатков существен для правильной пространственной организации полипептидной цепи белка независимо от его спектральных свойств.

В DsRed1 рядом с дополнительной двойной связью C_a=N остатка Gln65 расположен остаток Ser68, который, как полагают, участвует в образовании этой связи (рис. 10, а, г). Действительно, атом O_y остатка Ser68 рас­положен над связью C_a—N остатка Gln65 в положении, которое позволяет ему оттягивать протон (Yarbrough et al., 2001). Сравнение аминокислотных последовательно­стей GFP-подобных белков показало, что в белках с длинноволновыми спектрами флуоресценции в положе­нии 68 находится остаток Ser. Замена Asn68 на Ser (со­вместно с заменой Ile112 на Ser) приводит к появлению в dstrGFP дополнительной красной полосы в спектре флу­оресценции (Gurskaya et al., 2001). Желтый флуоресцент­ный белок zoanYFP в положении 68 содержит Asp, заме­на которого на Asn приводит к появлению дополнитель­ной зеленой полосы флуоресценции (Gurskaya et al., 2001). Исключением из этого правила является группа недавно открытых природных «флуоресцентных тайме­ров», таких как zoan2RFP, mcavRFP и rfloRFP, спект­ральные свойства которых изменяются в процессе созре­вания (от зеленой флуоресценции к красной или смешан­ной) (Labas et al., 2002). Несмотря на то что они содер­жат красный хромофор, в этих белках в положении 68 находится Asn, который характерен для большинства GFPs.

В DsRed1 с остатками Glu222, Gln65 и Ser68 взаимо­действует остаток Asn42, который определяет их «пра­вильное» расположение. Возможно, это объясняет суще­ственное увеличение зеленой флуоресценции, связанное с заменой остатка Asn42 в DsRed1 (Wiehler et al., 2001).

Единичная замена Tyr121 на His в DsRed1 приводит к тому, что в спектре флуоресценции этого мутанта до­минирующей становится полоса с максимумом при 500 нм и практически полностью исчезает полоса с мак­симумом при 580 нм (Wiehler et al., 2001). По-видимому, такая замена приводит к «неправильной» ориентации остатка Ser68, который в этом случае не может участво­вать в процессе дегидрирования Gln65.