Подготовка образцов к исследованию и проведение:

Образцы освобождают от жировой и соединительной ткани, погружают на 2-3 мин. в спирт и два раза обжигают с поверхности. Для приготовления суспензии стерильными ножницами из глубины исследуемых образцов (из разных мест) вырезают кусочки размером 2 х 1,5 х 2,5 см; лимфатические узлы разрезают пополам. Для приготовления мазков-отпечатков для бактериоскопии (2-10) одновременно с приготовлением суспензии отбирают кусочки мышц, лимфатических узлов, органов. Мазки фиксируют и окрашивают по Граму и одним из специальных методов (например, метод Ольта, Муромцева) для выявления капсул возбудителя сибирской язвы.

Для посева составляют две пробы по 15 г каждая (одна -из кусочков мышц и лимфатических узлов; другая - из кусочков печени, почек, селезенки. Каждую пробу помещают в стерильные стаканы гомогенизатора, куда добавляют по 15 мл физиологического раствора (1 мл полученной взвеси содержит 0,5 г продукта) и отстаивают 10 мин. Затем петлей или пастеровской пипеткой из верхнего слоя надосадочной жидкости каждой взвеси делают посевы на поверхность подсушенного МПА для обнаружения возбудителей некоторых зооантропонозов (сибирская язва, рожа свиней, листериоз, пастереллез, а также кокковые инфекции); на поверхность элективной среды (среда Эндо или Левина) - для обнаружения сальмонелл и бактерий группы кишечных палочек; в среду Киллиана- для выделения Salmonella cholerae suis; в одну из сред обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана и др.) - для накопления сальмонелл; в среду Б или Хейфеца- для обнаружения бактерий группы кишечных палочек; в конденсационную воду свежескошенного МПА (метод Шукевича) - для обнаружения бактерий рода Proteus; в среду Китта-Тароцци- при подозрении на анаэробные инфекции.

Посев в среду обогащения производят следующим образом: в одну колбу со средой вносят 10 г измельченной пробы из мышц и лимфатических узлов; в другую - 10 г измельченных кусочков паренхиматозных органов (сердце, селезенки, печень).

Посевы помещают в термостат при температуре 37°С. Через 18 ч. их просматривают визуально, при необходимости - через лупу или под микроскопом при малом увеличении.

Если роста не наблюдается через 18 ч., то посевы выдерживают в термостате дополнительно 6 ч. В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных средах проводят исследование на наличие возбудителя определенной инфекции. Проводимые исследования записывают в журнале по образцу приложения 1.

Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ) КОЕ /г. С этой целью из навески измельченного продукта готовят ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы было можно определить предполагаемое количество микроорганизмов в 1 г. Высев проводят одновременно на две чашки Петри по 1см³ соответствующих разведений в каждую. Не позднее чем через 15 мин добавляют 20см³ расплавленного и охлажденного до 45±1 МПА. Питательную среду тщательно размешивают круговыми движениями чашки по поверхности стола для равномерного распределения в ней посевного материала и после застывания термостатируют при 30±1ºС в течение 72±3ч.

Количество микроорганизмов в 1 г продукта определяют по формуле :

где – среднее арифметическое количество колоний в посевах;

n – число 10-кратных разведений навески продукта;

м – масса навески продукта, взятая для приготовления исходного разведения, г;

V – объем жидкости взятый для приготовления исходного разведения навески продукта, г.

Микробиологические показатели мяса убойных животных и птицы представлены в приложении А.

План работы.

Первый день:

1. описать патологоанатомические изменения и органолептические признаки исследуемых образцов;

2. приготовить мазки-отпечатки (от 2 до 10) из каждой пробы. Окрасить мазки по Граму, а также 2%-ным водным раствором сафранина или по Ребигеру, промикроскопировать препараты, записать результаты;

3. сделать посев из материала на пластинчатый мясо-пептонный агар, на пластинчатый агар Эндо (по секторам), или на другую элективную среду, на среду накопления и в конденсационную воду скошенного агара ( по Шукевичу);

Второй день:

1. изучить характер роста бактерий на мясо-пептонном агаре. Цветным карандашом по донышку обвести несколько колоний, приготовить из них мазки, окрасить по Граму, промикроскопировать;

2. определить по числу колоний, выросших на пластинчаом мясо-пептонном агаре, общую бактериальную загязненность мяса;

3. изучить характер роста бактерий на агаре Эндо или других элективных средах. Обвести цветным карандашом несколько колоний, похожих по внешнему виду на колонии бактерий сальмонеллезной группы;

4. приготовить мазки из подозрительных колоний на агаре Эндо, окрасить их по Граму, определить морфологию бактерий;

5. исследовать бактерии из подозрительных колоний на подвижность;

6. провести высев микробов из подозрительных колоний на короткий пестрый ряд (глюкозу, лактозу, сахарозу, манит) и в 2 пробирки со средой для определения индола и сероводорода.

Третий день :

1. прочитать пестрый ряд. Зафиксировать изменение сред пестрого ряда. Установить вид бактерий по изменению сред пестрого ряда;

2. поставить реакцию агглютинации с поливалентными и монорецепторными сыворотками. Прочить реакцию агглютинации;

3. сопоставить результаты исследований. Дать санитарную оценку мяса. Выписать экспертное заключение. Образец экспертного заключения представлен в приложении 2.

Специальные методы исследования

Выявление возбудителя сибирской язвы:

Обнаружение бацилл сибирской язвы. Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии и характера роста на питательных средах, а также изучение патогенности заражением лабораторных животных (белых мышей).

Бациллы сибирской язвы неподвижны, в организме образуют капсулы, а во внешней среде при доступе кислорода и температуре 12-42 °С - споры. При микроскопии мазков из патологического материала обнаруживают крупные грамположительные палочки, соединенные в короткие цепочки, а иногда цепочки имеют форму бамбуковой трости.

При окраске 2 %-ным раствором сафранина сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы и теки (следы распада бактерий) - в светло-желтый.

При окраске раствором Ребигера бациллы антракса окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы - в розовый.

На МПА через 16-24 ч бациллы растут в виде серо-белых, шероховатых с бахромчатыми краями колоний, напоминающих при осмотре с лупой «головку медузы» или «львиную гриву». Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с МПБ.

На МПБ сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, с образованием осадка, напоминающего комок ваты. Бульон остается прозрачным. Из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля. При микроскопии препарата под средним увеличением микроскопа обнаруживают неподвижные сибиреязвенные палочки.

Колонии, подозрительные на Вас. anthracis, отвивают на поверхность скошенного МПА и МПБ для получения чистой культуры, которую используют в дальнейшем для определения видовой принадлежности выделенного микроба. Для этого производят высев на цветной ряд,

состоящий из следующих сред: МПБ, МПА, МПЖ, молока, агара или бульона с кровью, ставят биологическую пробу на опытных животных, реакцию преципитации.

Иногда возникает необходимость дифференцировать сибиреязвенные бациллы от сапрофитных бацилл, которые морфологически очень сходны. В этом случае чистую культуру, выросшую на МПА или МПБ, исследуют: на капсулообразование in vitro, на гемолитическую активность, на тест «жемчужное ожерелье», на чувствительность к сибиреязвенному фагу или на свертываемость желтка куриного яйца.

Для возбудителя сибирской язвы в отличие от сапрофитных ба­цилл характерно отсутствие гемолиза как вокруг колоний на МПА, так и в МПБ с кровью.

Постановка биологической пробы:

Из исследуемого материала готовят взвесь на физиологическом растворе. 0,5 мл этой взвеси вводят двум белым мышам подкожно в область спины. При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) опытных животных заражают молодой (16-часового роста) чистой культурой. После гибели мышей, которая наступает через 24-72 ч., их вскрывают; из крови сердца, печени, селезенки и места заражения готовят мазки и производят посевы на питательные среды (МПА, МПБ). Одновременно с бактериоскопией исходного материала в сомнительных случаях проводят реакцию преципитации (РП).

Постановка РП:

Перед постановкой реакции свежий материал предварительно выдерживают в термостате 18-20 часов. Несвежий материал экстрагируют без выдерживания в термостате.

Экстрагируют 2 способами : горячим и холодным. Следует учитывать, что экстракты полученные горячим способом беднее преципитиногенами, чем при холодном.

Горячий способ : кусочки исследуемого материала (1-2 г) помещают в колбу, заливают физиологическим раствором в соотношении 1:10. Кипятят 30-40 минут в водяной бане.

Холодный способ : кусочки материала (1-2г) растирают в ступке с песком, переносят в колбу, заливают карболинизированным (0,3% ным )физиологическим раствором в соотношении 1:10 и оставляют на 16-18 часов при комнатной температуре.

Полученные экстракты фильтруют через асбестовую вату до прозрачного состояния.

Прозрачный экстракт в количестве 0,25-0,3 мл вносят в пробирку Уленгута и под него подслаивают или наслаивают такое же количество преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

В случае положительной реакции через 3-8 мин. на границе сыворотки и экстракта появляется серовато-белый диск -преципитирующее кольцо; при сомнительной реакции оно появляется через 10-15 мин.; при отрица­тельной- кольцо отсутствует.

При проведении РП контролем служат стандартный сибиреязвенный антиген и стандартная сибиреязвенная сыворотка, нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом, преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором. В первой контрольной пробирке должно образоваться кольцо, а в двух других - нет, т. е. реакция отрицательная.

Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву являются наличие капсул в мазках из органов, а в мазках из культуры -грамположительных палочек, расположенных в виде цепочек; концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены; характерный рост на МПА, МПБ, МПЖ; положительная РП и положительный результат биологической пробы.

При бактериологическом исследовании на сибирскую язву, особенно несвежего материала, часто обнаруживают большое количество посторонней микрофлоры. В этом случае трудно дифференцировать Вас. anthracis от антракоидов, псевдоантраксных палочек и других спорообразующих сапрофитных аэробов, положительно красящихся по Граму и имеющим колонии, сходные с колониями сибиреязвенного микроба.

Экспресс-методы дифференциации Вас. Anthracis и почвенных спорообразующих бактерий:

Для дифференциации необходимо сделать посевы на МПБ с кровью, МПЖ и исследовать культуру микроорганизма на подвижность. Для ускоренной дифференциальной диагностики возбудителя сибирской язвы и сходных с ним почвенных аэробных бацилл рекомендуется использовать следующие тесты: феномен «жемчужное ожерелье», чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу, свертываемость желтка куриного яйца, гемолитическую активность, феномен капсулообразования.

Феномен «жемчужное ожерелье»:

В две пробирки с МПА, содержащими 0,5 и 0,05 ед. пенициллина, и в контрольную пробирку без пенициллина (контроль I) вносят по 0,25 мл испытуемых 3-часовых бульонных культур. Культуры почвенных бацилл, засеянные на МПА и МПА с пенициллином, служат контролем II. Посевы помещают в термостат при 37°С. Через 3 ч. из конденсационной жидкости берут материал и готовят мазки, которые фиксируют в спирте - эфире и окрашивают метиленовым синим, разведенным фуксином, или по Граму.

При положительной реакции теста «жемчужное ожерелье» бациллы сибирской язвы, засеянные на МПА с пенициллином, приобретают шарообразную форму, а цепочки их имеют вид ожерелья. Споровые сапрофитные аэробы (контроль) имеют обычную форму палочек.