6.3.3.3. Ассимиляторное восстановление сульфата

Активация сульфата. АТФ-сульфурилаза. Первоначально относительно инерт­ный сульфат активируется: пирофосфорильная группа АТФ под действием фермента АТФ-сульфурилазы замещается сульфатом, в результате чего обра­зуются аденозин-5'-фосфосульфат (АФС) и пирофосфат (ФФ_Н) (рис. 6.49, ре­акция 1). АТФ-сульфурилаза представлена двумя сходными по структуре и кинетике реакции изоформами: пластидной и цитозольной. Обе формы есть и в листьях, и в корнях. В тканях корня активность фермента всегда ниже, чем в листьях. В пластидах образование АФС предшествует ассимиляторному восста­новлению серы. В цитозоле АФС в дальнейшем может быть использован в реак­циях сульфатирования. Реакциям сульфатирования предшествует образование 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфата (ФАФС), катализируемого

АФС-киназой (рис. 6.49, реакция 2).

Именно ФАФС является донором SO в реакциях сульфа­тирования (рис. 6.49, реакция 3), катализируемых сульфотрансферазами, лока­лизованными преимущественно в цитозоле. Но

ФАФС наряду с АФС может быть и субстратом для ферментативного восстановления.

Первый этап восстановления сульфата до сульфита до сих пор не считается окончательно установленным. По доминирующей гипотезе восстановление (рис. 6.49, реакции 4а, 46) проходит две стадии: перенос сульфата с АФС на глута­тион Г—SH с образованием S-сульфоглутатиона, катализируемый АФС-сульфотрансферазой (4а), и неферментативное восстановление

S-сульфоглутатиона за счет Г—SH с образованием Г—SS—Г и выделением сульфита (46).

Комплементарная ДНК (кДНК) пластидной АФС-сульфотрансферазы была выделена и клонирована у зеленых морских водорослей и арабидопсис. По струк­туре фермент оказался близок к тиолзависимым редуктазам (но не к сульфотрансферазам) и был назван АФС-редуктаза. Он состоит из трех доменов: на N-конце локализован транзитный пептид, который удаляется после транспорта белка в хлоропласт; далее следует собственно редуктазный домен, гомоло­гичный ФАФС-редуктазам бактерий; на С-конце расположен тиоредоксинпо­добный домен (рис. 6.50).

Рис. 6.50. Схема строения и работы АФС-редуктазы.

Две молекулы восстановленного Г—SH передают 2е на тиоредоксинподобный домен. Электро­ны по градиенту окислительно-восстановительного потенциала переходят на редуктазный до­мен и затем передаются на АФС. В результате выделяются свободный сульфит и окисленный

глутатион. Пояснения в тексте

Однако в тиоредоксинподобном домене последова­тельность аминокислот между двумя функционально активными молекулами цистеина типична для глутаредоксина. Именно эта последовательность опреде­ляет окислительно-восстановительный потенциал системы. Поэтому С-домен АФС-редуктазы функционирует как глутаредоксин, а не тиоредоксин. Уста­новленный факт объединения редуктазы и кофактора в одном белке позволил сформулировать новую гипотезу: реакция восстановления сульфата до сульфи­та катализируется белком АФС-редуктазой и состоит в переносе двух электро­нов от двух молекул восстановленного глутатиона через тиоредоксинподобный домен на АФС, при этом выделяются свободный сульфит и окисленный глутатион:

АФС + 2Г-SH → SO + 2Н⁺ + Г-SS-Г + АМФ

Таким образом, АФС-сульфотрансфераза и АФС-редуктаза — названия од­ного и того же фермента.

Второй этап восстановления. Сульфитредуктаза. На втором этапе сульфит восстанавливается до сульфида (6е ) под действием сульфитредуктазы (см. рис. 6.49, реакция 5). Донором электронов служит Фд_восст

SO + 6Фд_восст → S^2- + 6Фд_ок

Фермент локализован в пластидах и кодируется одним геном, который экспрессируется как в зеленых, так и в гетеротрофных тканях. Сульфитредуктаза растений — гемопротеин, состоящий из 2 или 4 идентичных субъединиц с мол. массой 64 — 71 кДа каждая. Подобно нитритредуктазе каждая субъединица суль­фитредуктазы содержит один сирогем и один железосерный кластер (4Fe-4S).

В отличие от АФС-редуктазы количество мРНК сульфитредуктазы в клетке практически не меняется и не зависит от доступности сульфата или количе­ства восстановленных соединений серы в клетке. Сродство фермента к SO очень высокое (К_т =10 мкМ), и это позволяет не накапливать токсичный для клетки сульфит.

Различают две изоформы сульфитредуктазы: в листьях — ферредоксинзависимую, в корнях — ферредоксин-НАДФ⁺-зависимую. Восстановление сульфи­та в хлоропластах обеспечивается энергией света, а в пластидах корней восста­новителем служит НАДФН из пентозофосфатного окислительного цикла.

Биосинтез цистеина. Совместная работа серинацетилтрансферазы и О-ацетилсеринлиазы обеспечивает превращение серина в цистеин. Включение S^2- в цистеин — последний этап ассимиляторного восстановления серы. Сульфид передается на О-ацетилсерин при участии фермента О-ацетилсеринлиазы (см. рис. 6.49, реакция 7). О-Ацетилсерин образуется из серина и ацетил-СоА в реак­ции, катализируемой серинацетилтрансферазой (см. рис. 6.49, реакция 6). Цис­теин — первый продукт восстановления сульфат-иона. Его концентрация в растительных тканях поддерживается на постоянном и довольно низком уров­не (10 мкМ). Считается, что Г—SH играет главную роль в регуляции размеров пула свободного цистеина.

В упрощенном виде последовательность реакций ассимиляторного восста­новления сульфата представлена на рис. 6.51.

Рис. 6.51. Схема ассимиляторного восстановления сульфата

Регуляция ассимиляции сульфата осуществляется на разных уровнях и раз­личными путями, которые сильно отличаются от регуляции нитратного и уг­леродного метаболизма. Восстановление сульфата преимущественно обеспечи­вается энергией фотосинтеза, но строго от света не зависит. Восстановление Фд_ок может обеспечивать окислительный пентозофосфатный цикл. Пул вос­становленного глутатиона, необходимый для работы АФС-редуктазы в пласти­дах, обычно не меняется. Более того, хотя активность восстанавливающих серу ферментов увеличивается в несколько раз после освещения растущих в темно­те растений, эти же ферменты активны и в этиолированных растениях, тогда как нитратредуктаза и Рубиско не экспрессируются в этиолированных расте­ниях. И наконец, в отличие от ферментов ассимиляции нитрата и углерода

ферменты ассимиляции сульфата не проявляют суточных колебаний актив­ности.

Более значимый фактор регуляции ассимиляции серы — стадия развития растения. Все ферменты ассимиляции серы активны в молодых листьях и кон­чике корня, и их активность заметно падает в более старых тканях. Ассимиляторное восстановление идет там, где велика потребность в цистеине и метионине для белкового синтеза.

Распределение SO между двумя клеточными компартментами (вакуолью и хлоропластом) — важный этап в регуляции усвоения сульфата. Концентра­ция сульфата в хлоропласте строго контролируется. При выращивании ячменя на среде с концентрацией сульфата 200 — 250 мМ концентрация SO в листь­ях увеличивалась в 10 раз: с 5 —10 до 60 — 70 мМ. Концентрация же сульфата в хлоропластах листьев ячменя увеличивалась при этом только в два раза: с. 4 — 5 до 10 — 12 мМ. Избыток поступающего в листья сульфата эффективно транс­портируется в вакуоль — основной сульфатзапасающий компартмент, где его концентрация может достигать 100 мМ.

При сульфатном голодании увеличивается активность всех ферментов, во­влеченных в последовательность реакций усвоения сульфата, особенно — АФС-редуктазы. Количество мРНК для этих ферментов повышается параллельно с повышением активности. Индукция

АФС-редуктазы хорошо выражена в кор­нях и в меньшей степени в листьях.